基于數據挖掘及網絡藥理研究古方治療強直性脊柱炎的用藥規律及相關藥理分析

姜 平，魏 凱，金曄華，張潤潤，常 岑，許林帥，何東儀*

1上海中醫藥大學，上海 201203；2上海中醫藥大學附屬光華醫院，上海 200052

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是以累及中軸關節和雙側骶髂關節為主的一種免疫介導的慢性炎癥性疾病，主要侵犯骶髂關節、髖關節、脊柱韌帶復合體并累及中軸骨等部位，引起被侵犯部位疼痛，骨關節破壞、僵硬，最終導致關節運動受限并出現強直與畸形[1]。臨床主要表現為腰、背、頸、臀和髖部疼痛，嚴重者可發生脊柱畸形和關節強直，嚴重影響患者生活質量。目前，AS發病率呈逐年上升趨勢，該疾病由Marie于1897首次描述，國內報道AS的患病率為0.22%[2]。其病因至今尚無明確結論，遺傳因素與AS關系密切，約90%的AS患者存在與人類白細胞抗原B27(HLAB27)等遺傳標記的關系[3,4]。Ruan等[5]發現，IL-12B(rs6871626)和IL-6R(rs4129267)的遺傳多態性與AS風險增加相關，并且還可以作為診斷和預后的生物標志物。臨床上AS的治療主要采取綜合性保守治療[6]，AS的首選治療藥物是非甾體抗炎藥物，但隨著生物制劑的發展，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抑制劑為NSAIDs 治療無效或不耐受的AS患者提供了新的治療方法[7]。TNF-α是一種與AS發病具有重要關聯性的細胞因子之一，在AS活躍期的監測和臨床診斷具有重要作用，而且現已證實TNF信號通路在AS發病過程中也發揮重要的作用[8]。而對TNF-α的特異性抑制劑，也已在臨床上大量使用于AS患者的治療，并取得良好的療效，已被證明可以改善脊柱和骶髂關節的炎癥狀況[9]。從古至今，中醫藥專家一直致力于對AS治療的不懈追求中，中醫藥在AS治療，改善AS癥狀以及提高遠期療效方面有著獨特的優勢。查閱古代醫籍，發現古代醫家治療AS疾病的方劑較多，但主要是針對個體的辨證論治，現代醫學研究缺乏對古代醫家治療AS疾病相關方藥組方配伍規律的挖掘與分析。因此，筆者采用數據挖掘技術[10]，以現代計算機和數據庫技術為依托，在大型的數據集中發現數據的模式和模型，從數據中發現知識，依托龐大的網絡數據庫和計算機信息處理，對采集的古方數據進行分析，研究古方間的關聯性并總結其組方配伍規律，探索古代醫家治療AS疾病的用藥經驗。同時應用現代網絡藥理學技術分析高頻次藥物組合，從分子作用層面進一步闡釋中藥治療AS的現代藥理機制，為中醫藥臨床治療AS疾病及新方的開發提供一定的臨床參考價值。

1 數據挖掘

1.1 資料與方法

1.1.1 古方來源

檢索中醫藥科學數據庫，在疾病子數據庫中分別檢索關鍵字段“痹”“脊痛”“腰痛”“大僂”“傴僂”“尻痛”等，年代設定為唐-清。

1.1.2 古方篩選

按照古代醫籍名稱如《本草綱目》《千金方》等將檢索得到的古方去重，然后根據疾病證候(如腰痛、脊痛、項強等)和功效主治(脊痛項強、腰似折、項似拔、腰痛如折、沉重如山等)進行篩選，納入符合標準的條目，排除不符的條目，如所治療之癥為“胸痹”“五臟痹”等，同時剔除用單味中藥制成丸劑、酒劑的方子，反復篩選符合上述要求的古方。

1.1.3 數據錄入

古方錄入采用“人工雙錄入模式”，即1人錄入、另1人核對，將篩選后符合條件的古方名稱、藥物組成錄入Excel 2017表格中，在錄入過程中參考2020版《中國藥典》[11]和“十三五”規劃教材《中藥學》[12]來規范中藥名稱，并同時錄入中藥的藥味、藥性、歸經和功效。

1.1.4 數據分析

用Excel 2017數據透視表統計中藥的藥味、藥性、歸經、功效分類的頻次、頻率。用SPSS Modeler 18.0及SPSS Statistics 20.0軟件對高頻中藥進行關聯規則[13]和系統聚類分析，統計高頻藥物組合并進行網絡可視化展示。

1.2 結果

1.2.1 中藥頻次統計

本研究共篩選出符合條件的古方179首，涉及中藥232味，藥物未被《中國藥典》和《中藥學》收錄者，則不納入統計，如茵芋、松脂、石龍芮等。綜上所述，本研究共統計中藥205味，總頻次1 707次，其中使用頻率≥1%的中藥有杜仲、肉桂、防風、牛膝、當歸、甘草、川芎、獨活等27味(見表1)，累計頻次991次，占總頻次的58.06%，屬于高頻藥物。

表1 頻率≥1%的中藥統計表Table 1 Statistical table of TCM with frequency≥1%

1.2.2 中藥藥味、藥性、歸經及功效分類統計

將205味中藥進行統計分析，結果顯示：藥味分析中，辛、甘、苦三味居前三位，累計頻率為84.27%；藥性分析中，溫、平、寒三性占主要地位，累計頻率為73.17%；藥物歸經分析中，205味中藥主要歸于肝、腎、脾、胃四經，累計頻率為64.93%；藥物功效分析中，補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥、解表藥、祛風濕藥為古代醫家常用藥(見表2、表3)。

表2 中藥藥味、藥性及歸經統計表Table 2 Statistical table of TCM taste,property and channel tropism

表3 中藥按功效分類統計表Table 3 Statistical table of TCM with efficacy

1.2.3 中藥聚類分析

結合上述中藥使用頻率表，將使用頻率≥1%的中藥運用SPSS Statistics 20.0軟件采用平均聯接(組間)的方法進行系統聚類分析，生成樹狀聚類圖(見圖1)，結合中醫理論分析，在聚類分析譜系圖上的類間距選擇為19時，可將藥物分為7類。Ⅰ類：防風、獨活、川芎、細辛、秦艽、肉桂、當歸、白芍；Ⅱ類：茯苓、人參、熟地黃、杜仲、牛膝、續斷；Ⅲ類：萆薢、丹參、黃芪；Ⅳ類：甘草、白術、干姜、附子；Ⅴ類：生地黃；Ⅵ類：生姜、羌活；Ⅶ類：補骨脂、小茴香、肉蓯蓉。

圖1 中藥樹狀聚類圖Fig.1 TCM’s tree of clustering diagram

1.2.4 中藥關聯規則分析

運用SPSS Modeler 18.0軟件對古方中高頻中藥(使用頻率≥1%)進行關聯規則分析，設置“弱鏈接上限”為20，“強鏈接下限”為35，結果得到頻數≥20的藥物組合35種(見表4)，其中包含14味中藥，按頻次排名前8位的藥物組合(強鏈接組合)依次是獨活-防風、當歸-肉桂、杜仲-牛膝、杜仲-肉桂、川芎-防風、防風-肉桂、川芎-獨活、牛膝-肉桂，藥物間的關聯應用網絡圖進行可視化展示(見圖2)，其中甘草具有調和藥性之功，處方配伍中可與大部分中藥同用，用藥頻率較大，故不納入關聯分析。然后利用Apriori建模進一步挖掘各藥物之間的配伍關系，設置支持度為10%，置信度為90%，調整最大前項數為5，分析挖掘出古方中潛在藥物組合，結果得到13對核心藥物組合(見表5)，且藥物組合的提升度都大于1，表明這些藥物組合具有統計學意義。研究分析可以看出在治療AS的古代方劑中，高頻藥物組合及核心藥對之間關聯緊密，其中防風、肉桂、杜仲、牛膝、當歸在多個藥物組合中頻繁出現，因此是中藥關聯規則網絡的核心藥物。

表4 古方中頻數≥20的藥物組合Table 4 Drug combinations with frequency≥20

圖2 藥物關聯網絡圖Fig.2 Network diagram of drug association

表5 中藥關聯規則分析Table 5 Analysis of association rules of TCM

1.2.5 中藥因子分析

對高頻中藥應用SPSS Statistics 20.0軟件進行因子分析，結果顯示KMO值為0.67>0.5，Bartlett球形度檢驗的卡方值為351，且P值<0.05，差異顯著，表明本數據具有較好的線性關系，可進行因子分析。在方法中選擇最大方差法旋轉分析，結果得到9個成分，即含有9個公因子，其累積方差貢獻率為64.25%，由碎石圖(見圖3)可以看出，從第9因子之后，線條趨勢趨于平緩。經過因子分析，形成高頻中藥的旋轉成分矩陣表(見表6)，之后根據旋轉成分信息表提取藥物因子分析組合(見表7)，最后產生因子分析圖(見圖4)。

圖3 中藥因子分析碎石圖Fig.3 LithotriPsy by factor analysis of TCM

圖4 中藥間因子分析旋轉空間成分圖Fig.4 Rotation space component diagram of factor analysis of TCM

表6 高頻中藥(使用頻率≥1%)的旋轉成分矩陣表Table 6 Rotational component matrix of high frequency TCM (frequency ≥1%)

續表6(Continued Tab.6)

表7 高頻中藥的因子分析組合Table 7 Factor analysis combination of high frequency TCM

2 網絡藥理分析

根據數據挖掘結果顯示，獨活-防風藥物組合出現頻次為42次，使用頻率最高，為進一步研究獨活-防風治療強直性脊柱炎的具體作用機制，現運用網絡藥理學方法進行深層次分析。

2.1 獨活-防風藥對的成分-靶點網絡

采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP數據庫)獲取獨活-防風的化學成分，TCMSP是國內相對完善的中藥成分靶點數據庫，收錄了中藥502味，相關靶點3 339個，同時對每個成分的藥動學參數進行了詳細的描述。依次檢索獨活和防風，獲得二者的活性成分。之后根據化學成分的藥動學參數(ADME)，按照化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)與類藥性(drug like，DL)篩選活性成分，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，獲得獨活-防風的有效成分。然后利用TCMSP數據庫檢索有效成分的作用靶點，并利用UniProt數據庫對獲得的靶點蛋白進行基因名標準化處理。結果獲得有效成分21個(見表8)，其中獨活和防風共有的成分為3個。共獲取作用靶點237個，并利用UniProt數據庫進行基因名標準化處理，將數據導入CytoscaPe 3.6.0軟件構建“獨活-防風成分-靶點”網絡圖(見圖5)，結果顯示共有節點102個，節點與節點之間的邊表示成分與作用靶點之間的相互作用關系，其中最大自由度為44，最小自由度為1，平均自由度為5.039，度值排名較高的成分為漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、珊瑚菜素(phellopterin)和5-O-甲基維斯阿米醇(5-O-methylvisamminol)，表明這些化合物是獨活-防風治療強直性脊柱炎的主要活性成分。

圖5 獨活-防風成分-靶點網絡圖Fig.5 RAB-SR of components-targets network diagram注：圓形節點代表中藥；六邊形節點代表活性成分；菱形節點代表靶點。Note:The circular node represents the TCM;The hexagonal node represents the active component;The rhombic node represents the target.

表8 獨活-防風有效成分Table 8 Effective components of RAB-SR

2.2 AS疾病靶基因的獲取及藥物-疾病核心靶點的篩選

在疾病相關數據庫(GeneCard、TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM)中分別以“Ankylosing Spondylitis”為關鍵詞檢索與AS相關的靶基因，限制靶基因物種類型為人類基因型，將幾個數據庫的數據合并，并剔除重復值，并同樣利用UniProt數據庫對靶基因進行驗證和補充，共獲得疾病靶點2 465個。利用R語言對藥物的作用靶點與疾病相關的作用靶點進行交集，得到藥物與疾病之間作用的交集靶點。之后應用Cytoscape 3.6.0中的BisoGenet插件對藥物成分靶點和疾病靶點進行分析，從而構建靶點蛋白間的關系網絡，再利用CytoNCA插件對獲得的網絡進行拓撲結構分析，對得到數據結果進行篩選，以“度值(degree)”大于等于2倍中位數的值為篩選條件，即“degree≥54”，篩選出784個候選靶點；然后對其進行degree、介值中心度(betweenness centrality，BC)以及緊密中心度(closeness centrality，CC)計算分析，再篩選出大于中位數的靶點，最終得到藥物作用于疾病的17個核心靶點，分別是IL6、TNF、NOS3、PTGS2、CXCL8、MAPK14、HSP90AA1、RELA、ESR1、CCL2、PPARG、KDR、AR、NOS2、TGFB1、MMP1、CASP9，17個核心靶點相互作用，共同構成藥物治療疾病的核心靶點網絡圖(見圖6)。

圖6 “藥物成分-疾病”核心靶點Fig.6 “Drug components-disease” core targets注：淺藍色代表度值小于54的靶點；黃色代表度值大于等于54的靶點；紅色代表度值大于93、介值中心度大于0.011、緊密中心度大于0.453的靶點。Note:The light blue represents targets with degree value less than 50;The yellow represents targets with degree values greater than or equal to 54;The red represents targets with degree values greater than 93,BC greater than 0.011,and CC greater than 0.453.

2.3 GO富集分析與KEGG通路分析

“3.2”項中得到的17個核心靶點需要通過進一步的基因注釋和通路分析才能確定其代表的功能。將核心靶點錄入David數據庫并進行GO生物過程分析和KEGG通路分析，結果得到相應的生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular components，CC)和分子功能(molecular functions，MF)條目共196個，根據P≤0.05且FDR≤0.05的篩選標準，選出每個項目中符合條件的前10個GO條目(見圖7)，其中BP包括轉錄正調控DNA模板(positive regulation of transcription，DNA-templated)、炎癥反應(inflammatory response)和細胞對脂多糖的反應(cellular response to lipopolysaccharide)等；CC包括細胞核(nucleus)、細胞質(cytoplasm)和細胞外區域(extracellular region)等；MF包括蛋白質結合(protein binding)、酶結合(enzyme binding)和蛋白質均二聚活性(protein homodimerization activity)等。同時，分析得到KEGG通路50條，也同樣以P≤0.05且FDR≤0.05為篩選標準，選出44條符合條件的信號通路，其中與AS相關的通路有7條，主要包括：TNF信號通路(TNF signaling pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、NF-κB信號通路(NF-κB signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)，表明獨活-防風可能通過上述通路作用于AS。之后將7條主要通路分析得到的靶點數及相應的P值繪制成氣泡圖(見圖8)，并將富集在通路上的基因進行可視化分析，繪制基因-通路關聯網絡圖(見圖9)。從圖9可知，一條KEGG通路可以富集到多個基因，而一個基因又可以同時出現在多條通路上，表明獨活-防風是通過多成分、多靶點、多通路來治療AS疾病。

圖7 獨活-防風治療AS生物進程結果分析Fig.7 Analysis of biological process results of RAB-SR in treatment of AS

圖8 KEGG通路分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway analysis

圖9 基因-通路關聯圖Fig.9 Diagram of gene-pathway association

3 討論

查閱醫學古籍中并無“強直性脊柱炎”這一病名，古代醫家根據患者四肢關節屈伸不利、疼痛、腰背部僵硬等癥狀將強直性脊柱炎歸為“痹證”“腰痛病”“骨痹”等范疇，現代著名醫家焦樹德教授將此病稱為“大僂”，并提出本病病因病機是由于內外合邪，內因腎督陽虛，外因風寒濕邪侵襲，最終導致外邪入里，損傷筋骨。Ma等[14]則認為AS主要是由于腎督有病，腎藏精，主骨生髓，腎陰陽之氣虧虛，不能溫煦筋脈，從而導致脊強厥冷，可見腎精的盛衰與骨的強度和生長發育關系密切?？v觀現代醫家，普遍認為本病在早期是以邪實為主，多因風寒濕等外邪所致，日久痰瘀互結，阻滯督脈，后期以肝腎虛衰、督脈虧損為本，簡單概括為“早邪、中瘀、晚虛”。中醫藥是中華文明的瑰寶，傳承歷史悠久，醫學文獻古籍數不勝數，隨著信息技術的發展，網絡數據庫為我們研究挖掘古籍提供了方便。尤其是古籍當中的方劑，是古代醫家辨證論治的體現，是診療經驗的總結，通過對古籍中方劑的分析不僅可以發現中醫藥治療某個疾病的處方用藥規律，而且也可以通過中藥四氣五味、歸經、功效等窺探出疾病的病因病機。本文第一部分主要就是通過網絡數據庫結合現代計算機技術，對古代醫籍中治療AS的方劑進行歸納整理分析。整理古方179首，統計中藥205味，并進行分析，發現古代醫家對AS病因病機的認識與現在醫家相似，認為AS主要是因為本虛標實，內外合邪導致[15]，而在治療用藥上主要是運用補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥、解表藥和祛風濕藥，如杜仲補肝腎強筋骨，牛膝、當歸活血化瘀、逐瘀通經，獨活、防風祛風除濕之痛等。藥物四氣五味中藥味以辛、甘、苦為主，藥性主要是溫、平、寒。辛能散、能行，溫驅寒祛風，辛溫可解表散寒，使風寒濕從表而解；甘平以補為主，扶正固本；苦寒可以清熱瀉火、燥濕。歸經集中于肝、腎、脾、胃經，AS侵犯部位主要是四肢關節與脊柱，肝主筋，腎主骨，脾胃為后天之本，脾胃運化正常，肝腎精血充足，則四肢筋骨關節功能正常。

聚類分析是一種探索式的分類方法，通過客觀化、科學化方式來研究中醫藥。筆者對使用頻率≥1%的中藥進行系統聚類分析，共聚為7類。其中補腎強骨藥物占多數，由于AS主要是肝腎虧虛，督脈受損，因而多采用補虛藥扶正固本。其次為活血化瘀藥和清熱藥，久痹成瘀，阻滯督脈，故而活血化瘀貫穿始終，瘀久化熱又配以清熱藥清熱除痹。此外，解表藥和祛風濕藥也占據著重要的地位，輔助治療AS，“風為百病之長”，AS中風寒濕外邪侵襲等多與風邪有關，故而解表散寒、祛風除濕。Ⅰ類為防風、獨活、川芎、細辛、秦艽、肉桂、當歸、白芍，防風、細辛、秦艽、獨活可祛風解表、除濕止痛，現代藥理研究表明防風、細辛具有解熱、抗炎、鎮痛作用；Ⅱ類為茯苓、人參、熟地黃、杜仲、牛膝、續斷，主要為補腎強骨、填精益髓藥物，其中熟地黃、杜仲、續斷還具有預防和延緩骨質疏松的作用，對AS晚期并發骨質疏松癥具有一定的治療；Ⅲ類：萆薢、丹參、黃芪，丹參活血化瘀通經，黃芪補氣生血，氣為血之帥，氣行則血行；Ⅳ類：甘草、白術、干姜、附子，甘草緩急止痛，干姜、附子溫里散寒，溫腎陽，驅邪外出；Ⅴ類：生地黃，生地黃清熱生津，現代藥理研究表明其具有增強體液免疫和細胞免疫的功能[16]；Ⅵ類：生姜、羌活，羌活解表散寒，祛風除濕之痛，還具有抗炎、鎮痛作用；Ⅶ類：補骨脂、小茴香、肉蓯蓉，補骨脂溫腎助陽，肉蓯蓉補腎陽、益精血，溫補先天之本。

此外，根據關聯規則方法，選取35對常用藥物組合，對35個藥物組合進行分析，結果發現這些組合主要是補虛藥、活血化瘀藥、解表藥、祛風濕藥之間相互組合，如獨活-防風(祛風濕藥-解表藥)、當歸-肉桂(補虛藥-溫里藥)、杜仲-牛膝(補虛藥-活血化瘀藥)等，可與排名靠前的高頻中藥相互對照，證實了其數據的可靠性。在中藥因子分析中，結果提取公因子9個，包括CF1：杜仲、牛膝、茯苓、續斷、秦艽(補虛藥、活血化瘀藥、利水滲濕藥、祛風濕藥)；CF2：防風、獨活(解表藥、祛風濕藥)；CF3：補骨脂、小茴香、肉蓯蓉(補虛藥、溫里藥)；CF4：當歸、熟地黃、人參(補虛藥)；CF5：附子、白術(溫里藥、補虛藥)；CF6：萆薢、黃芪、丹參(利水滲濕藥、補虛藥、活血化瘀藥)；CF7：生姜、羌活(解表藥)；CF8：生地黃(清熱藥)；CF9：干姜(溫里藥)。因子分析結果與關聯規則分析結果大致相同，從而驗證了數據的可靠性。

第一部分通過數據挖掘技術分析了古代醫家治療AS的處方用藥規律，中醫是經驗醫學，醫家辨證論治，通過積累的診療經驗來配伍應用中藥，并逐漸了解中藥的四氣五味、歸經和功效。而隨著現代醫學的發展以及中藥藥理學的深入研究，通過現代科學技術，對中藥進行藥理研究分析。本文第二部分通過選取古籍中治療AS運用頻率最高的獨活-防風藥對，應用多種網絡數據庫，對其進行網絡藥理學分析，進一步闡述獨活-防風治療AS的分子作用機制。 獨活作為常用的祛風濕藥，臨床應用廣泛。弘景曰：“一莖直上，不為風搖，故曰獨活”，《別錄》曰：“獨活，治諸風，百節痛風無久新者”。防風是解表藥中常用藥，功效解表散寒、祛風除濕止痛。《長沙藥解》：“行經絡，逐濕淫，通關節，止疼痛，舒筋脈，伸急攣，活肢節，起癱瘓，斂自汗、盔汗，斷漏下、崩中”，《本經》：“主大風頭眩痛，惡風，風邪，目盲無所見，風行周身，骨節疼痹，煩滿”。獨活-防風相配伍，獨活辛香走竄，能除伏風，勝濕氣，通經絡，止痹痛；防風升發疏散，祛風濕，開腠理，通血脈?！侗窘浭枳C》曰：“獨活散濕以化風，然時與防風合奏散風之功；防風祛風以行濕，然時與獨活協為除濕之助，”二藥相須為用，相得益彰。

本研究通過TCMSP數據庫分析發現，獨活-防風藥對中有效成分漢黃芩素(wogonin)和β-谷甾醇(beta-sitosterol)與多個靶點相互作用，關聯度高，說明它們可能是獨活-防風治療AS的關鍵成分，在藥理作用中具有重要地位。研究表明漢黃芩素給藥后可顯著抑制炎癥反應增加，其通過增加caspase-9、caspase-3等蛋白質分布來防止細胞凋亡，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[17,18]。β-谷甾醇具有免疫調節和抗氧化作用，減少NO的合成，抑制IL-6活性，抑制腫瘤壞死因子的聚集與釋放，具有抗炎、抗氧化等多種生理作用[19]。獨活-防風藥對中漢黃芩素和β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化，抑制細胞凋亡，提高機體免疫力等作用，很可能是治療AS的關鍵成分。每個藥物有效成分作用于多個靶點，為進一步闡述其作用靶點基因之間的關系，將成分所作用的靶點與疾病靶點進行網絡分析，篩選得到17個核心靶點，主要包括IL6、TNF、PTGS2、CXCL8等。其中有研究表明，IL-6會刺激炎癥細胞聚集，加速合成炎癥介質[20]；而TNF因子具有多種生物學活性，其作為重要的炎癥因子，可誘導IL-6表達，激發炎癥級聯反應，催化并放大炎癥反應及毒性作用，同時它還直接作用于血管內皮細胞，改變細胞通透性，從而造成細胞損害[21]；PTGS2可參與炎癥反應，是非類固醇類抗炎藥物重要靶點，該類藥物治療AS主要是通過抑制環氧合酶活性來減少PG的生成，從而抑制分泌炎癥因子，起到抗炎、鎮痛等作用[22]；CXCL8是一種促炎因子，加速了四肢關節軟骨細胞的炎癥表達，導致細胞凋亡，加重AS進程。綜上研究分析，IL6、TNF、PTGS2、CXCL8可能是獨活-防風治療AS的關鍵作用靶點。同時，這些關鍵靶點都基本富集在TNF信號通路、VEGF信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路和HIF-1信號通路等，并主要參與炎癥反應、細胞對脂多糖的反應、一氧化氮生物合成過程的正調控、NF-κB轉錄因子活性的正調控和血管生成等進程。相關研究表明，在AS晚期，機體內產生生化反應，產生的糖基化合物通過與其受體結合，可激活NF-κB，進而引起多種基因表達，并造成一系列炎癥反應，破壞骨細胞蛋白，阻礙骨修復[23,24]。HIF-1信號通路是成血管-成骨偶聯反應的重要通路，它調控著體內多項骨骼、血管生成基因的表達，促進血管形成的同時，協同促進骨的再生[25]。而TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等已被大量文獻報道，其與炎癥反應、免疫反應及破骨細胞分化、活化有著密切關系。因此，通過網絡藥理學分析可以看出，獨活-防風中漢黃芩素和β-谷甾醇等成分可能通過IL6、TNF、PTGS2、CXCL8等靶點作用于TNF信號通路、NF-κB信號通路和HIF-1信號通路等，形成多成分、多靶點、多通路的治療特點，從而發揮治療AS的作用。

綜上研究，通過應用數據挖掘技術和網絡藥理學技術對古代醫家治療AS處方用藥規律進行了總結分析，并進一步研究分析了其中高頻藥對獨活-防風治療AS的分子作用機制，直觀的驗證了獨活-防風多成分、多靶點、多通路治療AS的作用特點，也從側面揭示了中醫藥治療疾病的獨特性。但是，研究中也存在諸多不足之處，數據也存在一定局限性，雖然通過網絡藥理學技術初步預測了獨活-防風治療AS的核心作用靶點，為治療AS提供了新的研究思路，但同時也需要后續進一步的驗證，從而為臨床治療提供參考價值。