時間分辨熒光側流分析法檢測水中17β-雌二醇

王凌凌，王文龍，楊 成，徐正華，張 毅*，史學麗

（1. 江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學 食品學院 分析食品安全學研究所，江蘇 無錫 214122；3. 中華人民共和國黃埔海關，廣東 廣州 510730；4. 石家莊市婦幼保健院，河北 石家莊 050051）

17β-雌二醇（E2）是所有內分泌干擾物中具有最強活性的天然雌激素，常被用作更年期女性的內分泌調節藥物［1］。然而，當E2通過飲用水和食物在人體內積累超過安全閾值時，會損害人類健康、破壞機體平衡，甚至危害后代［2］。2002年我國農業部176號公告中明確禁止在飼料和動物飲用水中使用E2［3］，食品法典委員會（CAC）和中國國家食品安全標準也規定不得在動物食品中檢出E2。E2的檢測方法主要有色譜法［4］、電化學法［5］、表面增強拉曼光譜（SERS）法［6］等。其中，色譜法靈敏度高、穩定性好，但無法應用于現場檢測；電化學法和SERS法響應快速、靈敏，均可用于現場檢測，但穩定性和重現性較低。

側流分析（LFA）是一種紙基快速檢測技術，成本低、操作簡單、可實現現場檢測，目前已廣泛應用于臨床診斷、食品安全、環境監測等領域。側流分析技術在E2的檢測應用已有報道，Wang等［7］曾以膠體金為標記物、構建了E2等3種雌激素的LFA 試紙，并成功應用于牛奶加標樣的檢測。膠體金因其顯色結果肉眼可見而常用作LFA 顯色探針，但其靈敏度較低且讀數結果具有主觀性。為提高試紙靈敏度，可采用金納米花［8］、金納米棒［9］或對膠體金二次標記［10］，或以小分子有機染料［11］、量子點［12］、上轉換納米粒子［13］等為信號探針開發熒光型LFA，但上述熒光型LFA 存在試紙熒光背景干擾或需要高能量激光光源等弊端。

本文基于免疫識別和熒光共振能量轉移（FRET）原理，以偶聯E2 包被原（E2－BSA）的長余輝粒子（PLPs）為熒光供體，以膠體金標記抗體（CG－mAb）為熒光受體，建立了E2 的競爭型時間分辨熒光（TRF）LFA。本方法以低功率紫外燈為激發光源，以智能手機連拍功能實現TRF 模式采集試紙的檢測區熒光圖像，有效去除試紙熒光背景干擾進而提高信噪比；以余輝優良的大尺寸PLPs為熒光信號源并利用其在硝酸纖維素膜上不遷移的特性將E2競爭物固定于檢測區，巧妙解決了常規試紙對信號材料尺寸的納米級別限制和小尺寸PLPs余輝短暫的矛盾。本方法可應用于水樣中E2的快速、靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEM－2100HR 透射電鏡、SU8010 掃描電鏡（日本日立株式會社）；F－7000 熒光分光光度計（日本日立有限公司）；X 射線衍射儀（i國布魯克有限公司）；Nano-ZES Zeta 電位分析儀（英國馬爾文儀器公司）；Nicolet Nexus470傅立葉變換紅外光譜儀（FT-IR，美國熱電公司）；UV-3600 PLUS紫外可見近紅外光譜儀（日本島津公司）；ZF-8紫外燈箱（燈管功率6 W，上海嘉鵬科技有限公司）；e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），250 mm×4.6 mm，5 μm C18X Bridge柱，2475 FLR檢測器。

流動相：乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司），乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。LFA 試紙材料（上海杰一生物技術有限公司）：硝酸纖維素膜（NC 膜，Sartorius CN95），樣品墊（GL－b06玻璃纖維素膜），吸收墊（H5072纖維素墊），底板（型號DB-7）。長余輝材料（PLPs，杭州質誠科技開發有限公司）。吐溫-20（化學純）、蔗糖、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA，生物試劑）、17β-雌二醇（E2，國藥集團化學試劑有限公司）。雙酚A（BPA）、己烯雌酚（DES）、雌酮（E1）、雌三醇（E3）、檸檬酸三鈉二水化合物（上海阿拉丁生物技術有限公司）。小鼠抗E2單克隆抗體（mAb）、羊抗鼠二抗（上海羽朵生物科技有限公司）。所用試劑除特別注明外均為分析純。實驗用水為超純水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

湖水樣品取于江蘇省無錫市江南大學小蠡湖；自來水樣品取自實驗室自來水龍頭；飲用水樣品為桶裝洞庭山飲用天然泉水，購于蘇州碧螺天然泉食品飲料有限公司。

1.2 納米材料的制備

參考Dou 等［14］采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金（CG），通過吸附作用與mAb 偶聯制備CG－mAb，離心（30 min，4 ℃，10 000 r/min）后的產物以0.2 mL 重懸緩沖液（20 mmol/L 硼酸鹽緩沖液含5%蔗糖，1%BSA，pH 8.2）溶解儲存備用。

參考Wang、Yang 等［7，15］方法合成E2 羧甲基醚（E2－CME）和E2－BSA 偶聯物（E2－BSA）。參考Paterson等［16］對商品化的PLPs進行二氧化硅封裝，參考Chen等［17］修飾羧基。然后，以活性酯法將E2－BSA 與修飾了羧基的PLPs 進行偶聯制備E2－BSA－PLPs 復合物［18］，產物以2 mg/mL（以長余輝濃度計算）在PBS溶液中儲存備用。

1.3 TRF－LFA試紙的構建

在組裝并切割好的試紙檢測區（T 區）和質控區（C 區）分別滴加1.0 μL 2 mg/mL E2－BSA－PLPs 和0.5 μL 0.1 mg/mL羊抗鼠二抗，烘箱中37 ℃干燥30 min，于真空袋中4 ℃保存備用。

1.4 液相色譜條件

流動相：乙腈（A），2%乙酸－水（B），洗脫梯度：0～7 min，50%A；7～7.5 min，50%～100%A；7.5～10.5 min，100%A；10.5～11 min，100%～50%A；11～12 min，50%A。進樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min，柱溫：25°C；激發波長：280 nm，發射波長：310 nm。

1.5 實際樣品分析

對水樣進行檢測并做加標回收實驗，加標質量濃度分別為0、0.10、1.0、10 ng/mL。水樣不需前處理，直接將80 μL水樣與20 μL CG－mAb和10 μL運行緩沖液（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液含10%蔗糖，8%BSA，0.25%吐溫－20，pH 7.4）在離心管中混合5 min后，將試紙條插入離心管，25 min后讀取結果。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

TRF－LFA 試紙原理如圖1所示。C 區作為驗證試紙結果有效性的參照，始終顯紅色。樣品溶液和CG－mAb 預混合后在毛細作用下向吸水紙方向移動，當樣品無E2 時，CG－mAb 被T 區E2－BSAPLPs捕獲，肉眼可見T區顯紅色，而E2－BSA－PLPs和CG－mAb之間發生FRET使PLPs熒光猝滅，多余的CG－mAb 被C 區的二抗捕獲從而C 區也顯紅色；當樣品中含有E2 時，其與部分CG－mAb 結合減少了T 區捕獲的CG－mAb 總量，肉眼可見T 區顯淺紅色甚至無色，而E2－BSA－PLPs 和CG－mAb 間的FRET減少甚至消失，使PLPs的熒光恢復。隨著樣品中E2濃度的增大，被捕獲于T區的CG－mAb越來越少，T區逐漸變淡，而長余輝的亮度逐漸增大。當PLPs開始發出微弱的熒光信號時，所對應的E2最低濃度為熒光法的檢出限。為采集PLPs熒光信號，將顯色完成試紙條置于6 W 254 nm紫外燈下激發后，以智能手機作為熒光圖像采集設備，以連拍模式獲取紫外光源關閉前后的熒光圖像，從中篩取信噪比最高者用于分析。

圖1 時間分辨熒光側流層析示意圖Fig.1 Schematic illustration for TRF－LFA

2.2 CG－mAb和E2－BSA－PLPs的表征

2.2.1 CG－mAb的表征 采用透射電鏡對CG的形貌及制備質量進行表征，可見所制備的CG平均粒徑在15 nm 左右，大小均勻，分散性好（圖2A）。進一步采用紫外－可見吸收光譜和電位法對偶聯前后的CG 進行表征，可觀察到CG 在520 nm 處有最大吸收峰（圖2B），Zeta 電位為－26.0 mV（圖2C）；與mAb 偶聯后，CG－mAb 在278 nm（mAb）和525 nm（CG）處有吸收峰（圖2B），Zeta 電位從－26.0 mV 變至－18.1 mV（圖2C）。以上結果表明所制備的CG質量較好，表面成功修飾了E2－mAb，可以用于側流層析試紙。

圖2 CG的透射電鏡圖像（A），CG與CG－mAb的紫外－可見吸收光譜（B），CG、CG－mAb、PLPs和E2－BSA－PLPs的Zeta電位（C），E2－BSA與E2－BSA－PLPs的紅外光譜（D）Fig.2 TEM image of CG（A），UV－Vis absorbance spectra of CG and CG－mAb（B），Zeta potentials of CG，CG－mAb，PLPs and E2－BSA－PLPs（C），FT－IR spectra of E2－BSA and E2－BSA－PLPs（D）

2.2.2 E2－BSA－PLPs的表征 作為時間分辨熒光信號源的PLPs為商品化固相合成產物，采用掃描電鏡圖像對PLPs的形貌進行表征，可見其粒徑為微米級別，在NC膜上不遷移，符合預期；進一步采用X射線能量色散譜（EDS）對PLPs的元素組成進行測量，得到PLPs的化學組成為SrAl2O4基質，摻雜有1%（質量比）的Eu元素。供貨方聲稱摻雜有Dy元素，但可能由于摻雜量極少，EDS未檢出。PLPs的基質SrAl2O4是SrO－Al2O3體系中一種較穩定的化合物，其晶體結構中的大量缺陷可實現光子的吸收，而摻雜的Eu2+作為發光中心。通過紅外光譜法和電位法對E2－BSA修飾前后的PLPs進行表征，可觀察到E2－BSA－PLPs的FT－IR吸收光譜與E2－BSA基本一致（圖2D），修飾后PLPs的表面電位由3.1 mV變為－20.0 mV（圖2C）。

采用熒光光譜及紫外－可見吸收光譜分別對供體PLPs及熒光受體CG－mAb進行掃描。結果顯示，PLPs的最大熒光發射峰在520 nm，而CG－mAb的最大吸收峰也剛好在520 nm 左右（圖3A），滿足熒光共振能量轉移（FRET）要求熒光供體分子的發射光譜與受體分子的吸收光譜相重疊的要求。

紫外光照下，試紙和PLPs 均會發出熒光（圖3B 插圖①）；在關閉紫外燈后，試紙上的熒光立刻消失，而PLPs仍能發射熒光（圖3B插圖②）。熒光衰減曲線顯示在光源關閉后2 min左右時，PLPs的發光降低至初始強度的10%，20 min后降至1%（圖3B），表明該大尺寸PLPs具有優良的余輝性能。

圖3 PLPs的熒光發射光譜及CG－mAb的吸收光譜（A），PLPs的熒光衰減曲線（B）Fig.3 Fluorescence emission spectrum of PLPs and absorbance spectrum of CG－mAb（A），fluorescence decay curve of PLPs（B）

2.3 LFA條件的優化

2.3.1 CG－mAb 制備條件的優化 本文所設計FRET 型LFA 要求CG－mAb 能有效猝滅PLPs的熒光，因此需要CG－mAb 穩定且吸收強度高。以此為優化依據，考察了制備CG－mAb 時K2CO3（用于調節pH值）和mAb的用量。利用吸附作用制備CG－mAb時，體系pH值接近于抗體的等電點時能在CG表面實現最有效的吸附。因此，以添加K2CO3調節體系pH 值，發現K2CO3的濃度為0.4 mmol/L 時，CG 在520 nm波長下的吸光度值最大（圖4A），所以后續實驗選擇0.4 mmol/L K2CO3為最佳添加量。

膠體金表面抗體修飾量對于免疫識別起關鍵作用：修飾抗體過少，對抗原的識別難以實現；修飾抗體過多，不利于競爭型試紙消線（即T 區不捕獲CG－mAb）。在優化的K2CO3濃度下，當每毫升膠體金中抗體添加量小于5 μg 時，金標抗體出現不同程度的聚集，當抗體添加量大于5 μg/mL 時，金標抗體溶液保持紅色，狀態穩定（圖4B）。因此，選擇mAb 的最低用量為5 μg/mL。考慮到實驗過程中的損失，在最低用量的基礎上額外增加20%作為實際抗體量，即每毫升膠體金儲備溶液中添加6 μg mAb進行標記。

2.3.2 FRET 型試紙熒光供體和受體用量的優化 FRET 型試紙熒光供體E2－BSA－PLPs 和受體CG－mAb 的用量也是影響體系靈敏度的重要因素，因此，分別考察了顯色模式和TRF 模式下陰性樣品的信號強度以優化二者的用量。圖像用Image J 的灰度模式分析。顯色模式下可見隨著CG－mAb用量和T 區E2－BSA－PLPs 濃度的增加，T 區的顯色深度逐漸增加（圖4C）。當T 區的E2－BSAPLPs 質量濃度為1 mg/mL 時，T 區顯色過淺，不利于分析，E2－BSA－PLPs 在另兩個高質量濃度下，CG－mAb 的3 種用量結果差別不大。TRF 模式下，當T 區的E2－BSA－PLPs 質量濃度為1 mg/mL 時，陰性樣品和不同劑量CG－mAb 的混合物流過T 區后雖能完全猝滅其熒光，但由于其初始熒光亮度較低，陽性樣品的檢出較困難。當T 區E2－BSA－PLPs 濃度為4 mg/mL 時，雖然其初始熒光非常明亮，但陰性樣品和CG－mAb 混合物流過后很難完全猝滅其熒光，即使CG－mAb 的用量高達20 μL 也無法將熒光全部猝滅。因此T 區的E2－BSA－PLPs 質量濃度設定為2 mg/mL，此濃度下熒光亮度適中且20 μL CG－mAb 的猝滅效果最好（圖4D）。

2.3.3 激發時間及熒光照片采集時間的優化 激發時間和熒光照片采集時間也是TRF 型試紙的重要參數。因此，分析了陰性（0 ng/mL）和陽性（10 ng/mL）樣品在不同激發時間（5、10、20、40、60 s）和采集時間（0.1、0.5、1.0、1.5 s）下的信號強度，以尋找對分析物E2 最靈敏的時間參數。結果顯示，隨著激發時間的增加，陰性和陽性樣品試紙T 區的熒光均逐漸增強，20 s 達到光飽和，然而不同激發時間下陽性和陰性樣品的熒光差值變化不大，因此，為使陰性樣品具有盡可能低的熒光，后續實驗選取5 s作為激發時間（圖4E）。從熒光關閉前后連拍圖像分析發現，熒光關閉后陰性和陽性樣品T區的熒光亮度都逐漸降低。為了滿足陽性和陰性樣品的熒光差值較大且陰性樣品亮度較低的要求，選取0.5 s 作為熒光照片的捕獲時間（圖4F）。

圖4 制備CG－mAb時K2CO3濃度（A）和mAb濃度（B）對產物吸光度的影響；顯色模式（C）和TRF模式（D）下CG－mAb用量和試紙T區E2－BSA－PLPs用量對信號的影響；TRF模式下激發時間（E）和熒光照片捕獲時間（F）對信號的影響Fig.4 Effects of K2CO3（A）and mAb（B）concentrations on the absorbance of CG－mAb；Effects of E2－BSA－PLPs and CGmAb dosages on the signal intensity of visual mode（C）and TRF mode（D），respectively；Effects of excitation time（E）and fluorescence photo capture time（F）on the signal intensity of TRF mode

2.4 LFA分析性能

2.4.1 方法的檢出限 以所構建試紙檢測不同質量濃度E2 標準溶液并分析試紙T 區顯色和TRF 信號強度。顯色模式下，陰性和低濃度陽性試紙T區呈現明顯紫紅色，E2質量濃度增加至5 ng/mL時T區顏色變淡，10 ng/mL 時T 區顏色消失（圖5A），以此質量濃度為顯色法檢出限；TRF 模式下，陰性T 區無明顯熒光，E2 質量濃度為0.1 ng/mL 時T 區發出微弱的光（圖5B），以此質量濃度為TRF 法檢出限。因此，所構建的TRF型試紙的檢出限（0.1 ng/mL）較顯色法檢出限（10 ng/mL）約低2個數量級。

圖5 顯色（A）及TRF（B）模式下試紙對不同質量濃度E2的響應Fig.5 Response of the strip at different E2 concentrations under the visual image（A）and TRF image（B）modes

2.4.2 方法的選擇性 進一步考察了所構建試紙在顯色和TRF模式下對E2的幾種結構類似物的響應以驗證試紙特異性。10 ng/mL E2可使T區褪色（圖6A）、顯示熒光（圖6B），而10倍質量濃度的E1、BPA和DES的信號與陰性無顯著差別（圖6），表明與E2無交叉反應。5倍質量濃度的E3不干擾E2的檢測，但10倍質量濃度的E3會同時引起兩種模式下信號的改變（圖6B），這可能是由于E3較其他雌激素與E2的結構更為相似。

圖6 顯色（A）及TRF（B）模式下試紙對幾種雌激素類物質的響應Fig.6 Responses of strips to several estrogens under the visual image（A）and TRF image（B）modes

2.5 實際樣品的檢測

為確定本方法的有效性，以HPLC－FLD法對比分析水樣及其加標樣品（表1）。HPLC－FLD法可檢出10 ng/mL 加標E2，回收率為87.3%～96.4%，相對標準差（RSD）小于6.3%。CG－LFA 可檢出10 ng/mL加標E2。TRF－LFA法可檢出0.1 ng/mL及以上加標E2（圖7），且約30 min內即可完成分析。

圖7 顯色（A）及TRF（B）模式下試紙對加標水樣的響應Fig.7 Responses of strips to spiked water samples under the visual image（A）and TRF image（B）modes

表1 實際樣品中3種方法對E2的檢測結果（n=3）Table 1 Analytical results of E2 in real samples by three methods（n=3）

3 結 論

本文基于FRET 原理構建了E2 的TRF－LFA 方法，以余輝優良、微米尺寸的PLPs 為T 區固定熒光探針，低功率紫外燈激發結合智能手機拍攝實現TRF 模式熒光采集，有效去除試紙熒光背景干擾進而提高信噪比。該方法具有比膠體金顯色法低兩個數量級的檢出限和較好的特異性，且可在30 min 內完成檢測，適用于現場篩查。