在線固相萃取－同位素稀釋/超高效液相色譜－串聯質譜法測定蜂蜜中26種喹諾酮類化合物

張居舟，李 靜

（1. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051；2. 國家農副加工食品質量檢驗檢測中心，安徽 合肥 230051）

喹諾酮類藥物為人工合成的含4-喹諾酮基本結構的廣譜抗生素，可作用于細菌的脫氧核糖核酸的回旋酶，使細胞無法分裂，從而起到抗菌效果［1］。該類藥物目前已發展到第五代，為人畜共用，可預防不同種類動物的疾病。喹諾酮類藥物可防治蜜蜂的腐臭病、敗血病等，然而藥物濫用致使其在蜂產品中殘留。人類若長期食用含有喹諾酮類藥物的食品，會誘導致病菌產生耐藥性；若過量食用此類藥物，還會出現惡心、腹瀉、頭痛、眩暈，以及白細胞減少、肝損傷等不良反應，有致畸、致突變的潛在風險［2－3］。因此，國內外對食品中喹諾酮的含量均進行嚴格限定。我國規定，恩諾沙星、達氟沙星、雙氟沙星和沙拉沙星在家禽產蛋期禁用，并規定了其他動物源食品中的最大殘留限量［4］；洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星在食品動物中禁用［5］。歐盟規定了麻保沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、氟甲喹和噁喹酸的最大殘留限量，此類抗生素藥物也未被授權用于治療蜜蜂［6］。為規避市場監管，仍有企業非法使用標準規定之外的喹諾酮類抗生素，然而新一代喹諾酮類藥物的檢測方法尚未建立。因此，迫切需要開發一種能同時測定蜂蜜中目前上市的所有喹諾酮類藥物的檢測方法，進而為監管部門及蜂蜜進出口貿易提供技術支持。

目前，蜂蜜中喹諾酮類藥物的檢測方法有薄層色譜法［7］、高效液相色譜法（HPLC）［8－9］、高效液相色譜－質譜/質譜法（HPLC－MS/MS）［10－16］等，其中薄層色譜法適用于定性分析，HPLC 法的定性易受假陽性干擾，HPLC－MS/MS法集多組分的定性、定量和高效分離于一體，應用最為廣泛。喹諾酮類藥物結構相似，且存在同分異構體，文獻報道的前處理方法有經典固相萃取［10，14］、分子印跡固相萃取［16］、磁性多壁碳納米管固相萃取［15］、光纖固相微萃取［11］和QuEChERS［8，12］等，然而針對蜂蜜基質，上述方法均有各自的優勢和不足。本文應用在線固相萃取技術，提升了前處理效率，采用超高效液相色譜－串聯質譜的動態多反應監測（dMRM）模式，系統自動分配掃描時間，駐留時間更長，明顯提高了靈敏度，適合高通量快速分析；檢測26種目標物，較文獻［10］和國標［17－18］方法新增了尚未報道的那氟沙星、妥蘇沙星、克林沙星、莫西沙星、吉米沙星和巴洛沙星6 種藥物，可以滿足蜂蜜中喹諾酮類化合物高通量快速篩查和食品安全應急檢驗的需要。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 超高效液相色譜儀、6495 型三重四極桿串聯質譜儀（配電噴霧離子源，美國Agilent 公司），GX－271 ASPEC 全自動固相萃取儀（美國Gilson 公司），IKA MS3 Basic 型渦旋振蕩器（i國IKA 公司）。Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國Waters公司）。

標準品：克林沙星標準溶液（100 μg/mL，美國A ChemTek 公司）；加替沙星（純度98.5%）、鹽酸莫西沙星（純度99.8%）購于美國CATO 公司；吉米沙星（純度97%）、巴洛沙星（純度98%）、鹽酸妥蘇沙星（純度97%）購于加拿大TRC 公司；那氟沙星（純度97.6%）購于i國Dr. Ehrenstorfer 公司；其余19 種喹諾酮類混合標準溶液（100 μg/mL）購于美國A ChemTek 公司。內標：恩諾沙星－D5、諾氟沙星－D5、氧氟沙星－D3（i國Dr. Ehrenstorfer 公司）；環丙沙星－D8、培氟沙星－D5、沙拉沙星－D8、依諾沙星－D8、雙氟沙星－D3購于北京Manhage生物科技公司；氟羅沙星－D3、洛美沙星－D5、達氟沙星－D3、氟甲喹－13C3（美國A ChemTek公司），加替沙星－D4、莫西沙星－13CD3購于加拿大TRC公司，噁喹酸－D5購于上海ANPEL公司。

甲醇、乙腈（LC－MS 級）購于i國Merck 公司；甲酸（色譜純）購于美國ACS 公司；實驗用水由Milli－Q超純水機制備。

樣品：洋槐蜜、棗花蜜、荊條蜜、油菜花蜜、紫云英蜜、枸杞蜜、枇杷蜜、百花蜜、櫻花蜜均為本地市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 混合標準溶液：分別準確稱取10.0 mg（精確至0.01 mg）加替沙星、莫西沙星、吉米沙星、巴洛沙星、妥蘇沙星、那氟沙星固體標準品至100 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質量濃度為100 μg/mL的6種混合標準儲備液。再分別吸取1 mL克林沙星標準溶液、6種混合標準儲備液、其余19 種喹諾酮類藥物混合標準溶液于100 mL 容量瓶中，配成質量濃度為1 μg/mL 的26種混合標準溶液，于－18 ℃下避光儲存。

同位素內標混合溶液：使用甲醇－水溶液（體積比3∶1，諾氟沙星－D5、培氟沙星－D5溶液分別加2 滴鹽酸助溶）分別配制100 μg/mL 的各單標儲備液。再用甲醇稀釋成1 μg/mL 的15 種混合內標溶液，于－18 ℃下避光儲存。

分別精密量取上述混合標準溶液及同位素內標混合溶液適量，用1%甲酸溶液－甲醇（體積比10∶90）稀釋成0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L 的系列標準工作液，其中內標的質量濃度均為10 μg/L。

1.2.2 樣品前處理 稱取2 g（精確至0.001 g）蜂蜜于50 mL離心管中，準確加入100 μL 1 mg/L混合內標溶液和10.0 mL 1%甲酸溶液－甲醇（10∶90），渦旋混合至樣品溶解，10 000 r/min 離心3 min。將PRiME HLB 小柱置于全自動固相萃取儀萃取架上，調節流速為1 mL/min，吸取2 mL提取液過柱，收集流出液，過0.22 μm濾膜至樣品瓶，待分析。

1.2.3 色譜參數 色譜柱：Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相：A 為0.1%甲酸溶液，B 為乙腈；線性梯度洗脫程序：0～1.0 min，95% A；1.0～2.0 min，95%～90% A；2.0～3.0 min，90%～87% A；3.0～5.0 min，87%～85% A；5.0～7.0 min，85%～35% A；7.0～8.0 min，35%～10% A；8.0～9.0 min，10% A；9.0～11.0 min，10%～95% A。流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：2 μL。

1.2.4 質譜參數 離子源：電噴霧離子源（AJS ESI）；監測方式：dMRM；掃描模式：正離子掃描；干燥氣溫度：220 ℃；干燥氣流速：17 L/min；霧化氣壓力：2.1×105Pa；鞘氣溫度：340 ℃；鞘氣流速：11 L/min；毛細管電壓：3 000 V；噴嘴電壓：400 V；碰撞池加速電壓：5 V；碎裂電壓：380 V；其它質譜參數見表1。

表1 26種喹諾酮類化合物及15種內標的質譜參數Table 1 MS/MS parameters of the 26 quinolones and 15 internal standards

（續表1）

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

喹諾酮類化合物結構含有哌嗪環、羧基或喹啉環，其［M+H］+峰響應強度均較大，因此選擇［M+H］+作為分子離子峰。使用電噴霧離子源，正離子模式（ESI+），在m/z100～500 范圍內對母離子進行全掃描，比較各化合物的母離子響應強度，依次優化毛細管電壓、干燥氣溫度、干燥氣流速、霧化氣壓力、鞘氣溫度、鞘氣流速和噴嘴電壓；再分別進行子離子掃描，子離子主要為脫羧峰［M +H－CO2］+和脫羧后哌嗪環斷裂重排峰［M+H－CO2－C2H4NR］+［10］，在優化碰撞能及碰撞池加速電壓后，形成多反應監測（MRM）方法，進一步優化色譜條件，進行數據采集，在MRM 方法數據或圖譜的基礎上升級形成dMRM方法，每個化合物的保留時間窗口自動進行動態分配，靈敏度和峰形均有不同程度的改善。值得注意的是，氟甲喹和噁喹酸、恩諾沙星－D5和氧氟沙星－D3互為同分異構體，具有相同的母離子和碎片離子信息，需分別優化其單標標準溶液以確定各離子對的碰撞能，并通過各同分異構體在色譜柱上保留時間的差異，設置保留時間窗對峰進行定位。

2.2 色譜條件的優化

喹諾酮類化合物結構含有親油親水兩性基團，極性存在一定差異，實驗分別選擇Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Waters BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱進行分析，為避免在反向色譜柱上出現色譜峰拖尾現象，選擇0.1%甲酸溶液－乙腈為流動相，依次優化流動相的初始比、梯度洗脫曲線斜率和洗脫時間。結果表明，0.1%甲酸溶液不僅可為正離子掃描提供質子，提高離子化效率，且提高了峰的對稱性；C18色譜柱較HILIC 色譜柱的分離效果更佳。隨著洗脫曲線斜率的變小，洗脫時間的延長，各化合物被洗脫的速率變緩，可將互為同分異構體的氟甲喹和噁喹酸、恩諾沙星－D5和氧氟沙星－D3完全分離，26 種化合物的靈敏度和分辨率均滿足要求。在優化的梯度洗脫程序下，由于100 mm 長度的C18和HILIC 色譜柱需更長的分離時間，且分離效果和峰靈敏度均比50 mm 長度的色譜柱差，因此實驗采用50 mm的Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱，目標化合物的分離效果良好（如圖1）。

圖1 26種喹諾酮類化合物（2.0 μg/L）及15種內標（10 μg/L）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of 26 quinolones（2.0 μg/L）and 15 internal standards（10 μg/L）the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.3 提取條件的選擇

喹諾酮類化合物中含有叔氨基和羧基，溶于堿性或酸性溶液，可使用酸性或堿性溶液混合有機溶劑提取。實驗對1%甲酸溶液－乙腈（5∶95）、1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）、氨水－甲醇（5∶95）的提取效果進行了比較。結果表明，1%甲酸溶液－乙腈（5∶95）的提取液有少量白色沉淀，26 種待測物的回收率為65%～115%，其中氟羅沙星、克林沙星的回收率低于70%；1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）可將蜂蜜樣品完全溶解，26 種待測物的回收率為70%～128%，其中雙氟沙星的回收率≥120%。氨水－甲醇（5∶95）也能完全溶解樣品，除奧比沙星的回收率為32%外，其它待測物的回收率為75%～125%。

為進一步驗證各提取劑的效果，取6組陽性蜂蜜（其中含有不同濃度的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星及環丙沙星），應用上述3種提取劑進行提取。結果顯示，1%甲酸溶液－乙腈（5∶95）提取液只檢出氧氟沙星；氨水－甲醇（5∶95）提取液對低濃度樣品未檢出，1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）提取液與國標GB/T 20757－2006［17］的檢測結果基本一致，故選擇1%甲酸溶液－甲醇（5∶95）作為提取劑，并比較了不同體積比（50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、5∶95）的1%甲酸溶液－甲醇對26種待測物的回收率（如圖2）。結果顯示，體積比為20∶80時，除吡派酸、氟羅沙星、氧氟沙星、洛美沙星外，其余化合物的回收率明顯偏離100%，體積比為50∶50時整體回收率降至最低，凈化時的流速也最慢。實驗選擇對26種待測物回收率更佳的1%甲酸溶液－甲醇（10∶90）作為提取劑。

圖2 不同體積比的1%甲酸溶液－甲醇對26種待測物的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of 26 analytes by different volume ratios of 1% formic acid solution－methanol

2.4 凈化條件的選擇

蜂蜜含有氨基酸、有機酸、糖類、色素和少量蛋白質等［19］，針對蜂蜜的凈化方法有固相萃取和QuEChERS 等方法，本文考察了PRiME HLB 柱、HLB 柱［17］、PAX 柱［18］和QuEChERS［12］的凈化效果。稱取空白基質樣品進行10.0 μg/kg 的加標回收實驗，結果表明，PRiME HLB 柱可去除蜂蜜中有機酸、部分色素及糖類等雜質。從去除雜質效果看，HLB 柱與PAX 柱相當，PRiME HLB 柱和QuEChERS 次之。從回收率上看，PRiME HLB 柱優于HLB柱，均有24種目標物的回收率在80%～110%之間；QuEChERS次之；PAX 最差，只有10 種化合物的回收率大于80%，其余在22%～78%之間。實驗最終選擇凈化能力略弱，但回收率較好，且無需活化、淋洗和洗脫，操作過程更簡便的PRiME HLB柱進行凈化。

2.5 基質效應評價

基質效應（ME）是指在測定過程中，由于待測化合物的離子化效應被樣品基質改變，從而使響應信號受到增強或抑制的現象。目前評價基質效應的方法有標準曲線法和相對響應值法，本文采用標準曲線法考察喹諾酮類化合物在蜂蜜中的基質效應，ME=基質匹配標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率×100%。當ME＞115%時為基質增強效應；當85%≤ME ≤115%時基質效應可忽略；當ME＜85%時為基質抑制效應［20－21］。實驗考察了洋槐蜜、油菜花蜜和荊條蜜的基質效應（分別以ME1、ME2、ME3表示），表2結果表明，目標化合物及其同位素內標在各個峰蜜中的基質效應變化趨勢一致，荊條蜜較其他蜜的基質效應略小，奧比沙星、加替沙星等8種化合物的基質效應不明顯（89%～115%），麻保沙星等18種化合物為基質增強效應，其中，吡派酸、依諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、達氟沙星、環丙沙星的基質增強效應較強。

表2 26種喹諾酮類化合物及15種內標的基質效應（%）Table 2 Matrix effects of 26 quinolones and 15 internal standards（%）

基質效應的消除方法通常有基質匹配曲線、同位素內標、基質凈化法等［22］，本文選擇內標法減弱基質效應對目標物定量結果的影響。對于有同位素內標的待測物，選擇其同位素內標作為內標定量；對于無同位素內標的化合物，依據結構相似、保留時間相近、基質效應差異較小的原則選擇其它同位素內標定量（見表3）。

表3 26種喹諾酮類化合物的線性范圍、相關系數、定量下限、平均回收率及相對標準偏差（n=6）Table 3 Linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of quantitation，average recoveries and relative standard deviations of 26 quinolones（n=6）

（續表3）

2.6 線性范圍與定量下限

精密量取適量喹諾酮類化合物混合標準溶液，用初始流動相配制質量濃度為0.1～20 μg/L 的系列標準工作溶液，同時加入15 種內標（內標質量濃度均為10 μg/L），按優化的條件進行UPLC－MS/MS 分析。以定量離子和內標化合物的峰面積比為縱坐標（y），待測化合物和內標化合物的質量濃度比為橫坐標（x），繪制標準工作曲線，內標法定量。結果表明，26 種喹諾酮類化合物在各自的質量濃度范圍內線性良好，相關系數（r2）＞0.997。采用空白蜂蜜樣品添加待測物，以10倍信噪比（S/N≥10）對應的質量濃度確定為定量下限（LOQ），結果表明，26種喹諾酮類化合物的LOQ為0.5～2.0 μg/kg（見表3）。

2.7 準確度與精密度

按照本方法對空白洋槐蜜進行加標回收實驗，加標水平為低、中、高3 個濃度，每個濃度平行6 個。由表3 可知，26 種喹諾酮類化合物的平均回收率為79.5%～110%，相對標準偏差（RSD）為2.0%～12%，表明方法的準確度和精密度良好。

2.8 實際樣品檢測

為評價該方法的有效性，本實驗測定了隨機抽取的市售洋槐蜜、棗花蜜、荊條蜜、油菜花蜜、紫云英蜜各10份，枸杞蜜、枇杷蜜各5份，百花蜜、櫻花蜜各1份，共62份樣品。在2份紫云英蜜、3份洋槐蜜樣品中檢出諾氟沙星，檢出量為2.1～22.1 μg/kg；1份棗花蜜樣品中檢出氧氟沙星，檢出量為17.1 μg/kg；1份枇杷蜜中同時檢出3.4 μg/kg諾氟沙星和8.8 μg/kg氧氟沙星（如圖3）；其余樣品均未檢出目標化合物。

圖3 陽性樣品中諾氟沙星和氧氟沙星的選擇離子色譜圖Fig.3 Selected ion chromatograms of norfloxacin and ofloxacin in positive sample

3 結 論

本文建立了一種同時檢測蜂蜜中26種喹諾酮類藥物的在線固相萃取/超高效液相色譜－串聯質譜方法。蜂蜜樣品以1%甲酸溶液－甲醇（10∶90）提取，經PRiME HLB 小柱在線通過式固相萃取凈化后，回收率優于標準方法；液質聯用儀采用dMRM 采集模式，進一步提升了檢測靈敏度；15種同位素內標有效補償了基質效應帶來的定量偏差；并首次檢測了巴洛沙星等新一代喹諾酮類藥物，填補了相關物質檢測技術的空白。本方法操作簡便、快速，重復性好、靈敏度高、準確可靠，完全滿足蜂蜜的實際檢驗和風險監測需要。