基于生物素化納米抗體檢測擬除蟲菊酯代謝物3-苯氧基苯甲酸的研究

張譯豐，郭城釬，柳 彬，沈玉棟，王 弘，陳子鍵，羅 林，徐振林*

（1. 廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510640；2. 中國生物蘭州生物制品研究有限責任公司，甘肅 蘭州 730046；3. 福建省東山海關綜合技術服務中心，福建 漳州 363400）

擬除蟲菊酯類農藥是模擬天然擬除蟲菊酯合成的，含有苯氧烷基的環丙烷酯類化合物［1］。此類農藥具有神經毒性、生殖毒性、免疫系統毒性與腫瘤毒性等［2－5］，對人畜健康有一定危害。3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）是擬除蟲菊酯類農藥最主要的代謝產物，也是其重要的風險暴露評估指標。除蟲菊酯類農藥可通過環境接觸和食物鏈進入機體內，在人體中能被迅速吸收并代謝成極性更高的3-PBA，主要存在于血液和尿液中［6］。研究發現，成人尿液樣本中檢測到3-PBA的占比高達91.3%，中位數水平范圍為0.30～18.3 ng/mL［7－9］。調查顯示，男性不育癥患者尿液中的3-PBA 濃度與精子質量呈負相關［10］，同時研究表明3-PBA 具有抗雌激素的特性，會使生物體內分泌代謝紊亂［11］。目前3-PBA 作為尿液分析物已被美國、加拿大等國家納入衛生監測的研究對象［12］。3-PBA 的半衰期比菊酯類農藥更長（180 d），生物毒性更大，在土壤中的遷移速率也較快，人們有可能通過環境接觸3-PBA。因此開展3-PBA 的檢測方法研究，對實現對3-PBA及擬除蟲菊酯類農藥的監控和風險暴露評估具有重要意義。

儀器檢測法是檢測3-PBA的常用方法，主要包括高效液相色譜法（HPLC）［13－14］、液相色譜－質譜聯用技術（LC－MS）［15－16］和氣相色譜－質譜聯用技術（GC－MS）［17-18］。色譜法雖結果準確，但因操作較復雜、成本較高，難以用于大量樣品的篩查。免疫分析法是基于抗原－抗體特異性識別原理的分析技術，具有特異性強、檢出限低、檢測成本低、操作簡便、便攜等特點，適用于大批量樣品的現場快速篩選。針對食品、環境中3-PBA 的免疫分析方法主要有酶聯免疫吸附分析法（ELISA）和競爭性免疫層析技術。Chuang 等［19］建立了尿樣中代謝物3-PBA 的ELISA 檢測方法，并與GC－MS 法進行比較，相關系數達到0.95，檢出限為0.1 ng/mL，回收率為92%～100%。Wang 等［20］制備了抗擬除蟲菊酯類單克隆抗體，并建立了icELISA 法用于水樣中多種擬除蟲菊酯類代謝物的檢測，該方法的IC50為0.8 ng/mL，回收率為74%～108%。Kim 等［21］利用納米抗體建立icELISA 方法用于人尿中3-PBA 的檢測，IC50為1.4 ng/ mL，LOD 為0.1 ng/mL，同時通過使用攜帶噬菌體的納米抗體進一步建立Phage－icELISA 方法，回收率為80%～112%，檢出限低至0.01 ng/mL，比LC－MS/MS法的靈敏度更高。Liu等［22］獲得了抗3-PBA 的單克隆抗體，并制備出相應的試紙條用于河水中3-PBA的檢測，檢出限為1 μg/mL，反應時間僅10 min。

有關納米抗體的報道多為蛋白質等大分子，且納米抗體存在體內半衰期短等缺點［23］。針對小分子的駱駝源納米抗體在實際應用中靈敏度較低的情況，Kim等［21］首次用3-PBA半抗原偶聯甲狀腺球蛋白免疫羊駝，制備得到特異性較好的陽性克隆并用于icELISA法檢測人尿中的3-PBA。本研究在Kim等［21］獲得的3-PBA納米抗體的基礎上，建立了生物素化納米抗體的icELISA方法，從而為3-PBA的快速靈敏檢測提供了思路。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

3-PBA 質粒為加州大學戴維斯分校Bruce Hammock 教授饋贈；3-PBA（98%，Alfa Aesar 公司）；聚丙烯酰胺溶液（30%，Bio－Rad 公司）；甘油（≥99%，Biosharp 公司）；多聚辣根過氧化物（HRP）酶標記的鏈霉親和素（2～4 μg/mL，polyHRP－SA，Thermo 公司）；HRP 酶標記His 標簽多克隆抗體（1 mg/mL，上海艾博抗貿易有限公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（分析純，英國OXOID 公司）；考馬斯亮藍R－250（≥85%）、吐溫－20（96%）購自廣州速研生物公司；咪唑（≥99%）、卵清蛋白（OVA，98%）、牛血清蛋白（BSA，98.6%）購自美國Sigma 公司；酶標板、96 孔白色發光板（深圳金燦華實業有限公司）；N，N，N，N-四甲基乙烯二胺（98%）、十二烷基磺酸鈉（95%）、過硫酸銨（≥98%）、甘氨酸（≥99%）購自廣州健陽生物科技有限公司；葡萄糖（≥99.8%，上海博奧公司）；四環素（95%）、氨芐青霉素（≥85%）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG≥99%）購自上海源葉生物科技有限公司；生物素－NHS（85%，天津希恩思生化科技有限公司）。

1.2 3-PBA納米抗體的表達純化

挑取攜帶pComb3x－3-PBA 納米抗體表達載體的TOP 10F’大腸桿菌單菌落，接種到10 mL含氨芐青霉素（100 μg/mL）和鹽酸四環素（100 μg/mL）的LB 培養基（LB－Amp－TC）中搖菌（下文搖菌條件均為37 ℃，250 r/min）過夜。將過夜菌擴大培養到1 L 的LB－Amp－TC 中，搖菌至OD600nm值達到0.6～0.8時，加入IPTG 溶液（1 mmol/L）誘導表達12 h。菌液離心，棄去上清，加入5 mL TES 溶液（12.1 g Tris，0.093 g EDTA，85.575 g 蔗糖，500 mL 水，鹽酸調至pH 8.0），攪拌至沉淀完全分散，～80 ℃凍結，37 ℃解凍，反復凍融3次。最后一次解凍后加入12 mL純水和3 mL TES溶液，放入搖床10 ℃，180 r/min搖30 min，離心取上清液。上清液加入咪唑－磷酸鹽緩沖溶液（PBS）使咪唑終濃度為10 mmol/L，再加入1 mL Ni－NAT 填料充分混勻后轉移到層析柱中，使未與填料結合的非特異成分流穿。分別用10、20 mmol/L咪唑－PBS洗去未結合的非特異性成分，再用濃度為50、100、200 mmol/L的咪唑－PBS分別洗脫納米抗體并收集洗脫液。取適量流穿液及不同濃度咪唑洗脫液進行SDS－PAGE檢測。用0.01 mol/L PBS透析納米抗體洗脫液將咪唑除去，超濾管將蛋白溶液濃縮至1 mg/mL以上，-80°C保存。

1.3 3-PBA納米抗體生物素化

稱取5 mg 生物素－NHS 溶于200 μL DMSO，逐滴加入到5 mg 溶于pH 8.0 PBS 緩沖液的納米抗體（生物素與納米抗體的摩爾比為50∶1）中，4 ℃反應過夜，次日用PBS 透析未反應的生物素－NHS。透析結束后，進行icELISA驗證生物素化后抗體活性。其余分裝放置－80 ℃冰箱備用。

1.4 基于生物素化納米抗體的icELISA程序

將包被原用碳酸緩沖液稀釋至所需濃度，以100 μL/孔加入酶標板中，37 ℃水浴箱靜置過夜。次日洗滌2 次（每次用300 μL 含吐溫-20 體積分數為0.005%的PBS（PBST）），然后在吸水紙上拍干酶標板。加入120 μL/孔蛋白封閉液，37 ℃靜置3 h，然后倒掉孔中液體，在吸水紙上拍干，37 ℃烘干后使用或4 ℃密封保存備用。

用PBS將3-PBA納米抗體和3-PBA標準藥物稀釋至所需濃度，酶標板中每孔加入50 μL抗體稀釋液以及50 μL 3-PBA標準溶液，37 ℃孵育40 min，洗板5次，拍干。用PBST將polyHRP-SA 稀釋至合適濃度，每孔加100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板5 次，拍干。TMB 顯色液A 液和B 液等體積混勻后，每孔加100 μL，37 ℃反應10 min，然后每孔加入50 μL終止液（10%H2SO4），用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光值（A450nm）。

1.5 icELISA條件的優化

采用棋盤滴定法，分別對包被原和抗體進行稀釋（包被原質量濃度為500、250、125、62.5 ng/mL；抗體稀釋倍數為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000，體積比），用icELISA 法測定3-PBA 質量濃度為0的條件下各抗原抗體濃度組合的A450nm，選擇A450nm在1～1.5之間的抗原抗體稀釋組合，用icELISA 檢測不同3-PBA 濃度下的A450nm，用Logistics 函數擬合標準曲線，得出各個不同抗原抗體濃度組合下的IC50和最大吸光值Amax。

配制不同pH 值（5.4、6.4、7.4、8.4、9.4），不同PO3-4濃度（10、20、40、60、80 mmol/L），不同吐溫（Tween－20）體積分數（0.005%、0.01%、0.025%、0.05%）的PBS用于稀釋納米抗體和3-PBA標準藥物。在優化的緩沖液條件下，將polyHRP－SA稀釋不同倍數（1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000，體積比），用icELISA 法檢測不同濃度3-PBA 下的A450nm，用Logistics 函數擬合標準曲線，得出各不同抗原抗體濃度組合下的IC50和最大吸光值Amax。

綜合考慮Amax/IC50值較大且曲線擬合度較好的條件為優化條件。

1.6 樣品前處理

將環境水樣品（湖水、水庫水、自來水、飲用水）以8 000 r/min離心20 min，0.22 μm水系濾膜過濾后直接用于測定。

2 mL人尿液樣品用0.22 μm濾膜過濾后加400 μL 6 mol/L HCl，100 ℃水解1 h；加入4 mL pH 4.5的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液進行中和，再加入6 mol/L NaOH調至pH 4.0左右。用C8固相萃取（SPE）柱純化水解后的尿液樣品，具體操作如下：空柱依次加入2 mL 甲醇、2 mL ddH2O 以及2 mL 醋酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 4.0）活化SPE柱；向SPE柱中加入2 mL水解后的尿樣；向SPE柱中依次加入3 mL ddH2O、3 mL甲醇洗滌雜質，真空干燥10 min；用正己烷－乙酸乙酯（7∶3）加1%醋酸配成洗脫液，用3 mL洗脫液洗脫SEP柱上的3-PBA。洗脫液氮吹至近干后，用2 mL含10%甲醇的PBS復溶，－20°C保存。

2 結果與討論

2.1 3-PBA納米抗體制備及生物素化后活性表征

3-PBA 納米抗體經Ni-NAT 純化后的SDS－PAGE 結果如圖1 所示，控制上樣體積一致時，200 mmol/L 咪唑洗脫液的條帶明顯深于50 mmol/L和100 mmol/L時，說明用200 mmol/L 咪唑洗脫納米抗體的效果最佳；同時，由于抗3-PBA 納米抗體的等電點在8.1 附近，為避免納米抗體在純化過程中沉淀，需將洗脫液pH值調至遠離等電點。因此選擇pH 7.4的200 mmol/L咪唑溶液為洗脫液。

圖1 經Ni－NAT純化后3-PBA納米抗體的SDS－PAGEFig.1 SDS－PAGE image of 3-PBA nanobody purified by Ni－NAT

生物素化后的納米抗體用polyHRP-SA作為酶標物進行icELISA 檢測，當包被質量濃度為125 ng/mL，納米抗體的工作質量濃度為500 ng/mL 時，在1 μg/mL 3-PBA 標準溶液中的抑制率為92.2%，說明3-PBA 納米抗體生物素化成功。

2.2 icELISA反應條件的優化及優化條件下的標準曲線

本研究所建立的方法示意圖如圖2A 所示。抗原包被濃度、緩沖液離子濃度、pH 值、吐溫濃度、二抗稀釋倍數等條件是icELISA 方法的穩定性與靈敏度的重要影響因素，因此需優化上述因素以確定最佳的icELISA實驗條件。

2.2.1 icELISA 抗原、抗體濃度組合的優化 選定的包被原和抗體濃度范圍內，當包被原濃度越高，A450nm達到1.0～1.5時所需的抗體稀釋倍數越小，反之亦然。一方面，減少包被原濃度有利于3-PBA 與包被原競爭抗體結合位點；另一方面，減少抗體濃度有利于抗體與相對低濃度的3-PBA充分結合，從而提高檢測靈敏度。但由于A450nm達到1.0～1.5之間的抗原、抗體濃度呈此消彼長的關系，因此必須進一步通過3-PBA抑制曲線來選擇最優條件。選擇包被原質量濃度（ng/mL）－抗體稀釋倍數為500－1∶4 000，250－1∶3 000，125－1∶2 000，62.5－1∶500的條件測定3-PBA的抑制曲線。

如圖2B 所示，在包被原質量濃度從500 ng/mL 降低到125 ng/mL 的過程中，IC50值呈現減小趨勢，說明靈敏度增強；而當包被原質量濃度降低到62.5 ng/mL后，IC50值突然激增。從Amax/IC50值亦能看出，當包被原質量濃度為125 ng/mL，抗體稀釋2 000倍時，其比值最大。

圖2 基于生物素化納米抗體icELISA方法的示意圖及實驗條件的優化Fig.2 Illustration of the biotinylated nanobody based icELISA for 3-PBA and the optimization for experimental conditions

2.2.2 緩沖液pH 值的優化 抗體為具有活性的蛋白因子，pH 值過高或過低均會對其活性造成影響，也會影響抗體和藥物的溶解度。本文選定pH 值分別為5.4、6.4、7.4、8.4、9.4的PBS 作為反應體系測定3-PBA抑制曲線，結果如圖2C所示。在pH 6.4左右，Amax/IC50值達到最大。

2.2.3 緩沖液離子濃度優化 離子濃度對icELISA 反應有重要影響，本實驗分別選定10、20、40、60 mmol/L 等一系列磷酸鹽濃度的PBS 作為反應體系測定3-PBA 的抑制曲線。如圖2D 所示，隨著離子濃度的上升，Amax值呈下降趨勢，IC50值先降后升，當離子濃度為40 mmol/L 時，Amax/IC50值最高，說明此時icELISA反應的靈敏度最大。

2.2.4 吐溫濃度的優化 為研究吐溫－20含量對icELISA 法靈敏度的影響，本實驗在PBS中添加不同體積分數（0.005%、0.01%、0.025%、0.05%）的吐溫－20。結果顯示，當吐溫－20 的體積分數為0.005%時Amax/IC50值最高。因此，選擇在PBS中添加0.005%吐溫－20。

2.2.5 polyHRP－SA 稀釋倍數的優化 在確定3-PBA 納米抗體的最佳稀釋倍數和包被濃度后，polyHRP－SA 和前者反應的量也需優化。用上述確定的最優緩沖液條件將polyHRP－SA 分別按照1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000和1∶7 000倍（體積比）稀釋后進行icELISA 檢測。結果顯示，當稀釋倍數為1∶4 000時，Amax/IC50值最高。因此，選擇polyHRP－SA的最佳稀釋倍數為1∶4 000。

按照上述優化條件，得到本實驗的最佳icELISA 反應條件：3-PBA－BSA 包被質量濃度為125 ng/mL，3-PBA 納米抗體稀釋倍數為1∶2 000，反應緩沖液體系為pH 6.4，離子濃度為40 mmol/L，吐溫－20體積分數為0.005%的PBST溶液，二抗稀釋倍數為1∶4 000。

2.3 線性范圍及檢出限

在最佳實驗條件下，用質量濃度分別為200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.012 8 ng/mL的3-PBA系列標準溶液建立icELISA 標準曲線，經擬合得到該標準曲線的IC50為1.7 ng/mL，線性范圍為0.37～7.4 ng/mL（見圖3）。檢出限定義為抑制率10%對應的待測物濃度（IC10），經計算，得到LOD（即IC10）為0.15 ng/mL。

圖3 優化條件下3-PBA的標準曲線Fig.3 Standard curve of 3-PBA under the optimized conditions

2.4 樣品基質效應的消除

2.4.1 人尿樣品 采集4 個來源于不同人的尿液（陰性），過0.22 μm 濾膜后用pH 6.4 的40 mmol/L PBST 進行1、2、4、8 倍稀釋后，分別用于稀釋3-PBA 標準藥物，同時用PBST稀釋3-PBA 標準藥物作為對照組，分別進行icELISA 測定并繪制標準曲線。結果顯示，人尿液樣品通過0.22 μm 濾膜過濾后，需稀釋20 倍才能消除基質干擾，方法的靈敏度降低。圖4A為濾膜過濾后，不同稀釋倍數對其中一尿液樣品基質效應的影響。

為了優化前處理方法，尿樣先經過高溫酸水解，然后用SPE 柱進行純化和富集，再進行稀釋。由圖4B 可知，經過酸水解和SPE 純化的尿樣僅需稀釋8 倍后的標準曲線與PBST 標準曲線基本重合，即稀釋8 倍可消除基質效應。與直接過膜稀釋相比，酸水解和SPE 純化的前處理方法能顯著提高實際樣品的檢測靈敏度。

圖4 不同樣品前處理方法對人尿樣品基質效應的影響Fig.4 Influence of different sample pretreatment methods on matrix effect of a human urine sample

2.4.2 水樣品 取4 種不同環境水樣（湖水、水庫水、自來水、飲用水）經離心、過濾膜處理后，用pH 6.4的40 mmol/L PBST 進行1、2、4倍稀釋后，分別用于稀釋3-PBA 標準藥物，同時用PBST 稀釋3-PBA 標準藥物作為對照組，分別進行icELISA 測定并繪制標準曲線。結果顯示，環境水樣品稀釋不同倍數后，其標準曲線與PBST標準曲線高度重合，說明環境水樣品基質效應較小，不會對樣品檢測造成干擾。因此，環境水樣品經離心、過膜處理后，無需稀釋即可直接用于icELISA檢測。

2.5 加標回收率與相對標準偏差

采集人尿、湖水、水庫水、自來水和飲用水共8種陰性空白樣品，在本方法的線性范圍內選擇低、中、高3 個加標水平，按優化方法進行加標回收實驗，每種樣品測定3 次，取平均值。測得人尿樣品的加標回收率為87.6%～97.8%，相對標準偏差（RSD）為3.2%～10%；環境水樣品的加標回收率為78.0%～127%，RSD為0.83%～9.3%（見表1）。

表1 icELISA對實際樣品中3-PBA的回收率及相對標準偏差Table 1 Recoveries and RSDs of 3-PBA in actual samples by icELISA

3 結 論

本研究在前期獲得的抗3-PBA 納米抗體的基礎上，以pComb3X－3-PBA 表達載體制備3-PBA 納米抗體并進行生物素化。所得生物素化納米抗體以多聚HRP 標記的鏈霉親和素為酶標物建立了3-PBA 的icELISA 分析方法，優化了包被源濃度、抗體濃度、反應緩沖體系中離子濃度、pH 值、多聚HRP標記鏈霉親和素稀釋倍數等參數。最優條件下，3-PBA的檢出限為0.15 ng/mL，IC50為1.7 ng/mL，線性范圍為0.37～7.4 ng/mL。8 種實際樣品的加標回收率為78.0%～127%，RSD 均不大于10%。該方法的準確性高、操作簡便，可作為擬除蟲菊酯類農藥使用的暴露評價。