人體毛發中氯胺酮及其代謝物的超高效液相色譜－串聯質譜法檢驗及含量統計分析

侯 偉，張蕾萍，王繼芬，魏春明，盧 亮，仲利靜，劉浩田

（1.中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

氯胺酮（Ketamine，KET）自20 世紀60 年代發現以來，在較長一段時間內作為一種麻醉藥物被廣泛用于人類和動物醫學中，同時由于其止痛作用，小劑量氯胺酮也被應用于治療急慢性疼痛和抑郁癥［1－2］。氯胺酮作用于人體后會起到分離麻醉效用，產生一種與環境和自身分離的感覺［3］，這種特殊的麻醉效果導致使用者對其產生依賴性，進而逐步發展成為世界范圍內濫用最嚴重的毒品種類之一。氯胺酮可在人體肝臟中進行細胞色素P450亞型代謝，在代謝過程中，氯胺酮在酶的作用下發生去甲基化反應生成去甲氯胺酮（Norketamine，NK），再進一步羥基化形成羥基去甲氯胺酮（Droxynorketamine，HNK）［4］。在Ⅱ相代謝過程中，羥基去甲氯胺酮進一步與葡萄糖醛酸結合，之后由腎臟排出［5］。

目前，國內外對于氯胺酮和去甲氯胺酮的研究較為豐富，通常采用氣相色譜法和高效液相色譜－質譜聯用法等對生物體液中的氯胺酮及其代謝物進行檢驗［6－8］，但血液、尿液等生物體液樣本的檢測時效較短，不易采集和保存，難以反映受試者在數周乃至數月內的吸毒情況。另外，較少有對生物檢材中的氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮同時進行檢驗分析的研究，目前僅Lisa等［9］和Hasan等［10］開展了人體血液中3 種物質同時檢驗的研究，對于毛發檢驗領域的此類研究相對匱乏。而作為一種新型生物檢材，毛發具有其他生物檢材所不具備的特殊優勢，如易于采集和保存、不易摻假、檢測周期長、吸毒信息反映全面等［11－12］，自公安部2018年頒布《涉毒人員毛發樣本檢測規范》［13］后，毛發檢驗在法庭科學檢驗領域的作用愈發關鍵，正逐步成為公安機關打擊和監督毒品犯罪的重要依托，因此開展毛發樣本中氯胺酮及其代謝物的研究具有非常重要的理論和實踐意義。

基于此，本研究建立了一種高動能研磨結合超高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）檢驗毛發中氯胺酮及其代謝物去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的方法，優化了毛發的清洗和提取過程，同時采用建立的方法檢測毛發樣本，得到人體毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量數據，并結合統計學方法對數據進行分析處理，研究吸食者毛發中氯胺酮及其代謝物的含量分布規律，為基層公安處理相關涉毒案件提供理論支撐與方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Shimadzu 30A UPLC超高效液相色譜儀、AUW120D電子天平（日本島津公司）；Q－TRAP 5500串聯質譜聯用儀（美國AB Sciex 公司）；純水儀（美國Millipore 公司）；臺式高速冷凍離心機（i國Sigma 公司）；球磨儀（北京萬孚智能科技有限公司）；HGC－12型氮吹儀（美國PerkinElmer公司）。

1 mg/mL 的氯胺酮（KET）、去甲氯胺酮（NK）和羥基去甲氯胺酮（HNK）標準品均購于美國Supelco 公司；用甲醇稀釋后得到0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、100 ng/mL 3種物質的混合標準溶液。

甲酸、甲酸銨（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；丙酮、正己烷、二氯甲烷、鹽酸、十二烷基硫酸鈉、四硼酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

準確稱取0.2 g 十二烷基硫酸鈉固體加入100 mL 純水中制得0.1%十二烷基硫酸鈉溶液；向49 mL甲醇中加入1 mL鹽酸制得2%的酸性甲醇試劑；稱取0.382 g四硼酸鈉固體加入100 mL純水中制得硼砂緩沖液（pH 9.0）。

毛發樣本采集自浙江和云南近3 個月以來吸食過氯胺酮的志愿者，所有志愿者進行毛發樣本采集前均已簽訂知情同意書。采集方法為用干凈剪刀從靠近頭皮的后枕部頂點處剪下一綹頭發，使用錫箔紙包裹以防止靜電，置于紙質信封中并標明采集者信息和毛發生長方向。收集頭發樣本后，記錄每名志愿者的相關信息，包括姓名、性別、年齡、吸毒史和頭發燙染情況等。空白頭發樣本取自無藥物使用史的受試者后枕部頭發。所有樣品均在室溫下保存于樣品袋中，待分析。

1.2 樣品前處理

準確稱取50 mg頭發樣品于15 mL離心管中，分別加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉水溶液、5 mL超純水和5 mL 丙酮，每種試劑各洗滌2 次，每次清洗1 min。收集最后一次洗滌溶劑氮氣吹干并用1 mL甲醇復溶，待UPLC－MS/MS檢測。

將洗凈的頭發從離心管中取出，置于通風櫥中晾干。用剪刀將頭發剪成2～3 mm 左右小段，準確稱取20 mg 頭發并置于專用研磨管內，再加入1 mL 甲醇，振蕩混勻。使用球磨儀以3 000 r/min 研磨3 min，超聲處理2 h，取500 μL 研磨液于離心管中，以4 000 r/min 離心5 min，上清液經0.22 μm 有機膜過濾，待UPLC－MS/MS分析。

1.3 色譜－質譜條件

1.3.1 色譜條件 選用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。流動相：A 為含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨水溶液，B 為甲醇，流速0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.0 min，5%B；1.0～1.1 min，5%～20%B；1.1～3.0 min，20%～70%B；3.0～4.0 min，70%～95%B；4.0～6.0 min，95%B；6.0～6.1 min，95%～5%B；6.1～7.0 min，5%B。

1.3.2 質譜條件 采用電噴霧離子源正離子掃描模式（ESI+），多反應監測掃描模式（MRM）；離子源電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）壓力：35 MPa；霧化氣（GS1）壓力：55 MPa；輔助氣（GS2）壓力：60 MPa。氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的質譜參數見表1。

表1 氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的質譜參數Table 1 Mass parameters of ketamine，norketamine and hydroxynorketamine

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

實驗考察了甲醇、乙腈和0.1%甲酸乙腈為有機流動相時對3種待測物峰形的影響。結果顯示：以0.1%甲酸乙腈為有機流動相時，氯胺酮和去甲氯胺酮的色譜峰峰形較差，并產生雙峰現象；以乙腈為有機流動相時，3種待測物的響應較低，且羥基去甲氯胺酮的峰形較差，因此實驗最終選擇使用甲醇為有機流動相，并與含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨水溶液組成流動相進行后續實驗。優化色譜條件下的氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮（質量濃度均為2 ng/mL）的總離子流圖見圖1，3個化合物的分離良好，峰形尖銳對稱。

圖1 氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的總離子流圖（2 ng/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of ketamine，norketamine and hydroxynorketamine（2 ng/mL）

2.2 前處理方法的優化

2.2.1 清洗程序的選擇 毛發的清洗程序是前處理過程的重要環節，能夠清除毛發表面的污漬，避免其它雜質干擾檢測結果，然而滲透性過強的試劑在清洗過程中可能會造成待測物流失，因此清洗試劑的選擇非常重要。實驗考察了6 種清洗方式對毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮檢出效果的影響：不進行清洗處理（a），其余清洗程序均在超純水清洗后，換用丙酮（b）、甲醇（c）、二氯甲烷（d）、0.1%十二烷基硫酸鈉和丙酮（e）、丙酮和正己烷的混合溶液（體積比1∶1，f）各清洗2 次，每次1 min，所有試劑單次用量均為5 mL。將真實毛發樣本平均分成18 份，每份50 mg，分別使用以上6 種清洗方式處理，每種方法平行3 次，按“1.2”方法處理并檢測，取3 組平行樣本的平均值為該方法下的標準值，最終得到6 種清洗程序后的真實毛發樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的檢出效果差異見圖2。

圖2 不同清洗方法對氯胺酮及其代謝物的檢出效果影響Fig.2 Effects of different cleaning methods on the extraction of ketamine and its metabolites

由圖可見，不同清洗方法會影響氯胺酮及其代謝物的檢測結果，特別對于氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的影響較為明顯。經過清洗處理后的毛發，氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的檢出效果均優于未清洗的毛發，表明適當清洗可清除雜質而不造成此兩種物質的過量損失，其中方法e 清洗后對氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的檢出效果最佳，且去甲氯胺酮的效果相對較好，而經方法d處理后的效果最差，毛發中去甲氯胺酮的檢出量甚至低于未經處理的樣本，這可能是由于二氯甲烷在清洗過程中能夠滲透進入毛發內部，使得其中部分去甲氯胺酮溶解在清洗液中，從而降低了去甲氯胺酮的檢出量。綜上，最佳清洗方法選擇5 mL 的0.1%十二烷基硫酸鈉溶液、超純水和丙酮各清洗2 次，每次1 min。

2.2.2 提取程序的考察 考察了5種提取方法對毛發中氯胺酮及其代謝物檢出效果的影響：①將干凈毛發置于1 mol/L NaOH 溶液中，75 ℃水浴15 min，使用乙酸乙酯進行液－液萃取，萃取液在35 ℃氮氣流下吹干并用初始流動相復溶，進樣分析；②向裝有干凈毛發的離心管中加入1 mL甲醇直接超聲2 h，離心過濾后進樣分析；③向裝有干凈毛發的離心管中加入1 mL 甲醇并使用毛發研磨儀研磨，再超聲2 h，離心過濾后進樣分析；④向裝有干凈毛發的離心管中加入1 mL酸化甲醇（10 mL甲醇中含20 μL純鹽酸）進行研磨，超聲2 h，離心過濾后進樣分析；⑤加入1～2 mL 硼砂緩沖液（pH 9.0）并研磨，超聲2 h，使用乙酸乙酯進行液－液萃取，萃取液在35 ℃溫和氮氣流下吹干并用初始流動相復溶，進樣分析。將清洗完成后的毛發分為15份，每份20 mg，置于15 mL離心管中，分別使用上述5種方法進行提取處理，每種方法平行測試3 次，最終得到每種提取方法下真實毛發樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的響應值。以每種提取方法下3組平行樣本的平均值為其標準值，最終得到5種提取方法下3種物質的檢出效果差異。

結果顯示，在氯胺酮及其代謝物的提取過程中，使用堿消解和甲醇研磨超聲輔助提取的效果最好，這是由于堿性溶液和研磨時高速粒子撞擊使得毛發破碎較為完全，毛發中的物質得以充分釋放；使用硼砂緩沖液進行提取的效果相對稍差，可能是因為萃取過程造成了待測物的損失；使用酸化甲醇研磨和甲醇超聲的效果最差，這是由于氯胺酮及其代謝物屬于偏堿性物質，使用酸化甲醇難以在短時間內進行有效提取，而直接進行甲醇超聲無法破壞毛發的基本結構，因而難以將待測物充分釋放。與甲醇研磨超聲輔助提取法相比，堿消解雖然能夠將毛發破壞得更徹底，但存在基質效應高、操作復雜等缺點，同時在萃取過程中會產生乳化現象，影響實驗結果的準確性。綜合考慮，選擇甲醇研磨超聲輔助提取作為毛發中氯胺酮及其代謝物的最佳提取方法。

2.3 方法學考察

2.3.1 工作曲線、檢出限與定量下限 稱取干凈空白毛發8份，每份20 mg，分別置于8支研磨管中，使用移液槍向其中分別添加1 mL不同質量濃度（0.1、0.2、0.4、1、2、10、20、100 ng/mL）的氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的混合標準溶液并用氮氣吹干，制成0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5 ng/mg 的系列加標樣品，按“1.2”方法處理，進樣檢測后繪制氯胺酮及其代謝物的工作曲線（x為待測物濃度，y為對應峰面積），以3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限（LOD），以S/N=10計算定量下限（LOQ），結果見表2。結果顯示：3 種化合物在0.01～5 ng/mg 范圍內線性良好，相關系數（r）均不低于0.996 2，LOD為0.005～0.020 ng/mg，LOQ為0.01～0.05 ng/mg。

表2 3個化合物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of 3 compounds

2.3.2 基質效應、回收率與精密度 稱取清洗后的空白毛發9 份，每份20 mg，分別置于9 支研磨管中，向其中分別添加1 mL 不同質量濃度（1、10、100 ng/mL）氯胺酮及其代謝物的混合標準溶液并在穩定氮氣流下緩慢吹干，制成3 種物質含量為0.05、0.50、5.00 ng/mg 的毛發陽性樣本，每個樣本平行3 組，在優化條件下處理并測定，計算方法的回收率和基質效應［14］。制備同樣濃度梯度樣品在同一天內的早、中、晚3 個不同時間檢測，計算氯胺酮及其代謝物峰面積的日內精密度（RSD）；連續測定3 d，計算日間RSD。結果顯示：氯胺酮及其代謝物在優化條件下的回收率為86.7%～106%，基質效應為88.1%～99.6%，日內RSD 為0.72%～4.1%，日間RSD 為1.9%～6.3%（表3），表明方法的準確性及精密度良好，完全滿足毛發中氯胺酮及其代謝物的檢驗要求。

表3 3個化合物的回收率、基質效應和精密度（n=3）Table 3 Recoveries，matrix effects and precisions（n=3）of 3 compounds

2.4 毛發陽性樣本數據統計學分析

實驗收集了50 份氯胺酮吸食者毛發樣本，其中男性樣本38 份，占樣本總數的76%，女性樣本12份，占樣本總數的24%，采用建立的UPLC－MS/MS方法分析，結果見表4。

表4 毛發陽性樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量Table 4 Content distribution of KET，NK and HNK in the positive hair samples

由表4 可見，50 份真實毛發樣本中均檢出氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮，含量分別為0.30～73.80 ng/mg（均值為8.84 ng/mg）、0.04～5.98 ng/mg（均值為1.05 ng/mg）和0.30～58.90 ng/mg（均值為8.91 ng/mg），其各自的分布情況如圖3所示，其中橫線及數字表示平均含量。

圖3 毛發陽性樣本中氯胺酮（A）、去甲氯胺酮（B）和羥基去甲氯胺酮（C）的含量分布情況Fig.3 Content distributions of ketamine（A），norketamine（B）and hydroxynorketamine（C）in the positive hair samples

由圖可知，去甲氯胺酮的含量范圍較窄，分布較為集中；而氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量范圍較寬，整體呈現非正態分布，少部分毛發樣本具有較高含量，從而明顯拉高了含量均值，因此需采用分段統計的方法進一步分析。根據Musshoff 等［15］的分析方法，可將3 種物質的含量經由低到高的順序排序后再按照百分位分段，各百分位的值和其他相關數據如表5所示。

表5 3個化合物的百分位值（p）、平均值、標準偏差（SD）、最小值和最大值Table 5 Percentile values（p）for 3 compounds，average，standard deviation（SD）and minimum and maximum values（ng/mg）

根據表5 中百分位分段統計可知，50 份真實毛發樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的平均含量均高于（50%），分布明顯偏斜。超過90%的樣本中氯胺酮的含量不高于20 ng/mg，其中超過半數樣本含量位于1～10 ng/mg 范圍內，另外僅有不到10%樣本中氯胺酮含量高于20 ng/mg，且分布較為分散；去甲氯胺酮在毛發中的含量低于氯胺酮且分布相對集中，標準偏差為1.33 ng/mg，近75%樣本中去甲氯胺酮的含量低于1 ng/mg；羥基去甲氯胺酮在毛發中的含量分布與氯胺酮相似，多數樣本含量低于20 ng/mg。

根據以上數據，結合向平等［16］的分段統計方法，可將毛發中氯胺酮及其代謝物的含量大致分為低、中、高3個層次，相關數據見表6，其中氯胺酮和羥基去甲氯胺酮均以1 ng/mg和10 ng/mg為劃分節點，去甲氯胺酮則以0.2 ng/mg 和1 ng/mg 為劃分節點。由于分段標準的差異會影響最終結果，本劃分方法僅做參考。

表6 3個化合物在不同層次下的含量范圍、平均值、樣本數及所占比例Table 6 Content ranges，average values，sample numbers and proportions of 3 compounds at different levels

采用數據分析軟件IBM SPSS Statistics 26 對50 份真實毛發樣本中氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的含量進行相關性檢驗，結果發現去甲氯胺酮和氯胺酮、羥基去甲氯胺酮和氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮含量之間的皮爾遜相關系數（Pearson correlation coefficient）分別為0.871、0.945 和0.913，表明三者間呈正相關，且相關性較為顯著。其中羥基去甲氯胺酮與氯胺酮含量之間的相關性相對較高，由表4 數據可知兩者間的含量比率均在1.00 上下浮動，表明兩者在毛發中的含量較為相似；去甲氯胺酮與氯胺酮之間的含量比率在0.05～0.60之間，這與Salomone等［17］將兩者間的最小濃度比設定為0.05這一研究結論較為契合。

由于個體在服用劑量、自身代謝、頭發顏色、吸毒習慣等方面的差異，吸毒人員毛發中的氯胺酮及其代謝物的含量不盡相同，因此目前國內外對于毛發中氯胺酮及其代謝物的陽性認定閾值尚存在一定爭議。本研究中50 份真實毛發樣本中氯胺酮的最低含量為0.30 ng/mg，高于國際毛發分析協會（The society of hair testing，SOHT）和國內相關技術規范所建議的0.20 ng/mg 的陽性閾值，但低于Leung 等［18］和歐洲工作場所藥物測試協會（European workplace drug testing society，EWDTS）［19］所建議的0.40 ng/mg 和0.50 ng/mg 的陽性閾值。本研究的含量數據可為氯胺酮及其代謝物的陽性閾值提供一定參考，但由于樣本數量不足，尚難以提出確切的閾值建議。然而相關研究表明，堿性藥物進入人體后，其中所含陽離子基團會與黑色素的羧基之間產生靜電吸引作用，從而促進藥物與毛發的結合，毛發中黑色素的含量越高，結合藥物的能力越強［20］。根據該理論，中國人頭發中的黑色素較國外部分人群更為豐富，相同條件下氯胺酮及其代謝物更容易與之結合并沉積，因此研究認為氯胺酮及其代謝物的陽性閾值應不低于國外相關權威標準，即不低于0.20 ng/mg。此外，由于毛發處理過程中可能會存在一定污染而造成假陽性結果，因此還需參考毛發中原藥與代謝物的含量比率等數據來最終認定是否為陽性。

3 結 論

本研究建立了超高效液相色譜－串聯質譜檢驗毛發中氯胺酮及其代謝物去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮的分析方法，并考察和優化了毛發的清洗程序，該方法簡單、易于操作、回收率高、重現性好，能夠滿足基層公安對于毛發檢材的檢驗要求。應用該方法檢驗了50份毛發樣本，并對氯胺酮、去甲氯胺酮和羥基去甲氯胺酮在陽性毛發中的含量數據進行分段統計，獲取了氯胺酮及其代謝物在不同含量區間的數據分布情況，初步分析了氯胺酮原藥及其代謝物的含量關系和陽性閾值，該數據可為涉毒案件的辦理以及后續研究吸毒人員毛發中的毒品含量提供借鑒和依據。