滾環擴增技術在病原微生物檢測中的應用

張世佳，馮建軍，郭松林，王藝磊，林 鵬

（集美大學 水產學院，鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，農業部東海海水健康養殖重點實驗室，福建 廈門 361021）

滾環擴增（RCA）［1］是模擬病毒遺傳物質滾環式復制而建立的一種擴增技術。1994 年，Nilsson 等［2］合成鎖式探針（Padlock probe）并應用到RCA 技術后，使RCA 技術得到了極大發展，開始應用于醫學［3］、食品科學［4］等領域。相較于常見的分子檢測手段，由于是恒溫擴增，無需昂貴的儀器，恒溫水浴鍋便可進行，避免了復雜的反復升降溫過程，為現場和在線檢測提供了可能。此外，基于鎖式探針的滾環擴增反應具有極高的特異性，檢測序列與結合引物引發擴增的中間序列互不影響，可采用一種引物對多種鎖式探針擴增，實現多靶標檢測［5］，且由于RCA 擴增效率高，有效放大了檢測信號，極大地提高了檢測靈敏度［6］。RCA技術在生物傳感領域的研究進展已有報道［7－8］，本文首次綜述了RCA技術在病原菌、病毒以及其它病原微生物檢測中的應用，并對RCA技術在該領域的前景進行了展望。

1 RCA技術原理與分類

通過模擬病毒或質粒的復制過程，環狀DNA 在具有鏈置換活性的聚合酶和引物作用下得以實現擴增［9］，RCA技術即在此基礎上發展而來。RCA反應通常需以下條件［10］：①環狀DNA或RNA模板；②與環狀模板部分互補的DNA引物；③具有鏈置換性的聚合酶。根據擴增引物數量可將RCA技術分為單引物擴增RCA（Single-primer RCA）［11］、多引物擴增RCA（Multiple-primer RCA）［12］和指數擴增RCA（Exponential RCA）［13］（圖1）。單引物RCA 是指在具有鏈置換性聚合酶的作用下由單一引物引發環狀模板延伸，產生長單鏈重復序列的DNA 分子，可生成幾千倍模板序列的拷貝，連接和擴增均在等溫條件下進行，無需復雜的變溫儀器，但單引物引發的滾環擴增效率相對較慢，且對低豐度序列檢測能力不足。多引物RCA 則在單引物RCA 基礎上，增加了1條或多條與模板互補的引物引發擴增，其擴增效率可達到單引物RCA的數倍，但相應的背景信號也有所上升，易造成結果假陽性。指數RCA是在單引物RCA 的基礎上額外加入一條與模板鏈序列一致的短單鏈作為引物，這條引物結合到RCA 擴增出來的線性DNA 產物上，開始擴增反應，新合成的產物又可作為第一條引物的模板進行擴增，如此反復，成指數級增長，但與多引物RCA一樣，易造成假陽性結果。

圖1 RCA的分類Fig.1 Classification of RCA

而目前較為流行的基于鎖式探針的RCA［14］其優點及創新表現在探針的設計：該探針設計了兩端具有與目標靶序列完全互補配對的兩個檢測端T1和T2、與引物結合的擴增序列P1和P2以及用于雜交的識別序列zip（圖2）。在反應過程中，探針的T1和T2端和目標靶序列毗鄰互補，在連接酶作用下連接成環，有一個堿基不能匹配就無法成環，保證了檢測的特異性。基于鎖式探針的RCA 實質是對環化探針進行擴增，并非對靶序列進行擴增，最大限度地減少了交叉污染以及實際樣品中抑制因子的影響，放大了信號值，有助于檢測靈敏度的提高。

圖2 鎖式探針Fig.2 Padlock probe

2 RCA在病原檢測中的應用

病原微生物是指侵入生物體引起感染甚至傳染病的微生物，常見的病原微生物包括細菌、病毒、真菌、衣原體、支原體等，病原微生物不僅會造成極大的經濟損失，而且嚴重威脅人體健康［15］。傳統的微生物檢測（如染色鏡檢和分離培養）［16］靈敏度低、檢測周期長，本課題組曾采用免疫法檢測嗜水氣單胞菌［17］，該法快速簡單，但其靈敏度和特異性與細菌抗體的質量密切相關。常見的分子檢測手段如聚合酶鏈式反應（PCR）特異性強、靈敏度高［18］，但需昂貴的熱循環儀。而RCA 技術不僅具有分子檢測手段的優點，且無需特殊的變溫設備，硬件限制少，此外還可進行多靶標、高通量檢測，操作簡單、反應迅速。

2.1 細菌檢測

細菌是許多疾病的病原體，其檢測具有廣泛的應用前景，RCA 技術可在較短時間內實現極微量的分子檢測，并結合電泳［19］等手段進行分析，獲得理想結果。近年來報道的RCA檢測細菌總結于表1。

表1 滾環擴增技術在細菌檢測中的應用Table 1 Application of the RCA in bacteria detection

由表1 可見，直接RCA 法（未與其它技術聯用）簡便、快速、靈敏度高、特異性強，在細菌檢測領域發揮了獨有優勢。黃冠軍等［20］根據柑桔潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodispv. citri）獨有的蛋白基因設計鎖式探針，建立了柑桔潰瘍病的RCA檢測體系，靈敏度可達20 cfu/μL，高于常規的PCR法。且其它植物病原菌不干擾測定，特異性高。但該法需結合電泳檢測結果，步驟較為繁瑣。

跨越式滾環擴增（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）是近年來RCA研究的熱點，傳統RCA擴增模板須是閉合環狀，但SRCA在Bst DNA聚合酶和引物作用下，沿靶序列擴增，擴增到靶序列兩端缺口時，通過添加堿基的方式跨越缺口，實現開環擴增，如果再加一條模板鏈序列一致的引物，即形成SRCA的指數擴增（圖3）［21］。這種方式無需鎖式探針和連接酶環化，操作步驟簡單，反應過程縮短，檢測成本降低。同時由于其擴增產物是雙鏈DNA，加入SYBR Green Ⅰ試劑即可直接實現結果的可視化。張蘊哲等［21］利用SRCA檢測人工污染雞肉中沙門氏菌（Salmonella enterica），借助SYBR Green Ⅰ直接觀察檢測結果，檢出限為5.6 fg/μL。Milton 等［22］將SRCA、PCR 與實時定量PCR 法檢測沙門氏菌進行對比，SRCA 法的檢測限最低，可達40 cfu/g。SRCA 法檢測嗜酸耐熱菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）［23］也被報道。

圖3 跨越式滾環擴增原理［21］Fig.3 The principle of SRCA［21］

RCA 作為一種信號擴增和放大技術，可與多種生物傳感器技術聯用，擴增產物通過與帶有信號的標記物相結合，實現擴增信號的直接讀取，克服了直接RCA 法必須電泳才能查看結果的弊端（圖4），利用熒光法讀取結果，簡單方便，靈敏度高。Chen 等［24］將環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）與RCA 技術結合，采用分子信標配對擴增產物發射熒光，進行鼠傷寒桿菌（Salmonella typhi）的實時檢測，檢測限為32 cfu/μL，該方法利用LAMP技術替代鎖式探針的環化過程，縮短了擴增時間。Sun 等［25］利用金屬有機骨架化合物可吸附單鏈DNA 和猝滅熒光的能力，熒光的猝滅和恢復可通過對單鏈DNA的吸附和解吸實現，將其與RCA相結合，檢測大腸桿菌O157∶H7，方法的特異性強，檢出限可達40 cfu/mL。基于熒光檢測的RCA法也用于檢測克羅諾桿菌（Cronobacter spp）［26］，且顯著提高了檢測靈敏度。但熒光檢測需昂貴的儀器，且熒光容易被猝滅，導致結果出現偏差。比色生物傳感器儀器簡單，更適用于實時的現場檢測，但其靈敏度比熒光生物傳感器低，且比色讀取易受體系基質干擾，產生誤讀。Zhang 等［27］開發了一種競爭性適配體生物傳感器，生物素標記的RCA 引物通過鏈霉親和素連接在適配體上，適配體與單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）接觸后，利用競爭關系釋放出生物素標記的引物引發RCA 反應，形成生物素標記的長單鏈DNA，與辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素反應，生成生物素－親和素－HRP－DNA 產物，加入HRP反應底物，通過吸光度確定單核增生李斯特菌的濃度。該方法設計新穎，利用適配體的競爭關系實現了檢測。化學發光生物傳感器以化學發光的形式定量待測物含量，發光強度與化學發光反應速率相關，反應速率與待測物相關，檢測成本低、快速、靈敏度高。Xu 等［28］結合適配體探針（Aptamererprobe，AP）、RCA 和切刻酶擴增技術（Nicking enzyme amplification reaction，NEAR），在AP 探針和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）結合時，釋放出互補序列作為切刻酶擴增反應和RCA 反應的引物，RCA 在互補序列的引發下形成大量G四鏈體（G4）結構，與血紅素形成G4/血紅素復合物，催化H2O2完成魯米諾氧化，發出化學發光信號，可檢測低至5 cfu/mL 的金黃色葡萄球菌。RCA 有核酸原位擴增的特點，可用來設計固相或半固相生物傳感器，與電化學信號轉換器相結合，具有靈敏度高、重復性好的優點，但該法需特定儀器，且對環境要求比較苛刻。Zhou等［29］開發了一種基于RCA、DNA walker的電化學生物傳感器，通過RCA擴增產生多個重復序列，該重復序列與DNA walker探針互補形成多足DNA walker，通過金膜上電流信號檢測銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），最低可檢測10 cfu/mL。此外，Li等［30］也基于電信號輸出，設計了一種超靈敏的生物傳感器用于檢測大腸桿菌O157∶H7的靶基因，檢出限為7 cfu/mL。Aissa 等［31］采用磁珠收集濃縮大腸桿菌（Escherichia coli）DNA，通過測量電化學信號檢測大腸桿菌，檢測限為3.0×105cfu/mL。Kordas等［32］將RCA 技術與壓電式聲學傳感器結合，開發了一種無標記的細菌檢測手段，并用于沙門氏菌的檢測，方法可在無特殊標記的情況下利用傳感器對芯片的聲比率進行檢測，從而有效檢出沙門氏菌的存在。Huang 等［33］另辟蹊徑，將RCA 技術和納米金探針以及紙基傳感器結合，檢測到最低100 pg/μL的總RNA，該方法造價低廉，且結果可視化，在現場檢測領域具有極大潛力。

除了傳感器讀取信號，Zhang 等［34］設計了一種新奇的結果可視化的RCA 方法，在磁珠上設計大腸桿菌O157∶H7 的核酸適配體，利用競爭關系釋放出RCA 引物，由此引發兩個部分互補的環狀序列進行滾環擴增，產生兩個長單鏈DNA，它們互相雜交，形成肉眼可見的DNA水凝膠，該方法對大腸桿菌O157∶H7的檢出限為4.0×103cfu/mL，1 h內即可完成檢測，在食品安全檢測方面具有應用潛力。

2.2 病毒檢測

病毒在食品中殘存時間較長，受污染的食品一旦被食用，會在體內大量復制繁殖，造成感染。楊金宏等［35］采用直接RCA 對桑花葉萎縮類病毒（Mulberry mosaic dwarf vrioid，MMDVd）的特異性基因設計鎖式探針，并結合凝膠電泳檢測，該方法可檢測到103拷貝。方法簡便快捷，且提高了檢測靈敏度和特異性。

RCA 同樣也常結合熒光傳感器用于病毒檢測，Jia 等［36］利用氧化石墨烯熒光猝滅的特性構建了ssDNA 生物傳感器，當檢測體系中存在埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）目的基因時，鎖式探針在酶的作用下成環，反應產物經酶處理后形成大量ssDNA，這些ssDNA 被裝有熒光素標記肽的氧化石墨烯吸附后，與熒光素標記肽結合產生大量dsDNA 復合物，導致氧化石墨烯對熒光素標記肽的吸附力減弱，標記肽解脫出來，恢復熒光，反之熒光素標記肽被吸附在氧化石墨烯中，熒光猝滅。Hamidi 等［37］將RCA 與比色讀數相結合，DNA 聚合擴增時釋放出大量焦磷酸分子，焦磷酸分子與Mg2+螯合后會使羥基萘酚藍（HNB）發生顏色變化，利用這種特性實現了對流感病毒H5N1（Influenza virus H5N1）的檢測，檢測限為7.6 fmol/L。結合電化學傳感器的RCA 檢測病毒也有報道，He 等［38］通過在電極表面修飾一層多孔牛血清白蛋白（BSA），改善捕捉探針在電極表面的分布，使探針位置分布更均勻，能更好地結合RCA 產物，產物和捕捉探針的結合改變了電極信號，基于此特性可用于人乳頭瘤病毒16 型（Human papillomavirus，HPV）的檢測。

Wang等［39］報告了一種基于固相RCA 檢測SARS病毒的方法，加入涂有低聚糖的磁珠，SARS－CoV 3′端上的多聚腺苷酸（Poly A）會與磁珠上的低聚糖結合，進而通過磁鐵和磁珠將SARS的RNA從液體中分離出來，從而為RCA反應提供有利條件，這種方式的檢測限可達單個拷貝。

2.3 其它病原微生物檢測

真菌在自然界廣泛存在，部分淺部真菌侵害皮膚表層和皮膚淺層，而一些深部真菌侵犯皮下組織、黏膜和內臟，威脅生物體的生命健康。Najafzadeh 等［40］建立了外瓶霉（Exophiala；Exophiala isolates）的RCA檢測體系，可及時診斷由外瓶霉引起的大腦皮層真菌感染，為后續治療提供良好的依據。

支原體廣泛存在于人和動物體內，無特定的形態，無細胞壁，可通過黏附作用和宿主的人細胞結合，釋放出大量氨，對細胞產生較大傷害。王輝等［41］對細胞污染支原體的16SrRNA、16S－23SrRNA間隔區和23SrRNA 的序列進行blast比對，找出高保守序列設計5 種探針，并采用公共引物對其進行RCA擴增，凝膠電泳檢測，結果和PCR 法進行比較，無交叉反應，證明RCA 技術對于支原體的檢測是一種行之有效的手段。

部分藻類在生長過程中會分泌對水生動物、哺乳動物乃至人類有害的物質，Liu等［42］針對劇毒卡爾藻（Karlodinium veneficum）設計了一種雙缺口滾環擴增，該擴增方式依靠兩個探針LP 和SP，LP 是兩端與目標序列互補配對的一段長單鏈序列，SP 是一段與目標序列互補配對的序列，且SP 的互補序列在LP兩端互補序列之間，只有兩端都與目標序列互補配對后，才能在連接酶的作用下成環，結合橫向流試紙條技術可達到可視化檢測的需求。相同技術也可用于檢測海洋卡頓藻（Chattonella marina）［43］。如Nie 等［44］針對海洋卡頓藻設計了特異性鎖式探針，并進行RCA 反應，結果應用反向斑點雜交技術進行檢測，2 h 內完成全部反應，該方法可使用肉眼進行觀察。此外米氏凱輪藻（Karenia mikimotoi）的檢測也已見報道［45］。針對有害藻的檢測可以有效避免赤潮和水華的產生，為生態治理提供預警。

3 總結與展望

RCA 相較于傳統的分子檢測手段如PCR 技術，具有高靈敏、高特異、恒溫擴增的優點，這使得RCA 不局限于實驗室使用，可望在養殖現場進行實時檢測。但仍存在一些問題函待解決：①分子檢測的前提需提取核酸，但步驟繁瑣，樣品前處理復雜，檢測時間較長，限制了其應用范圍；②RCA 擴增后結果需結合電泳、熒光、電化學等儀器查看，不易直觀觀察得出結論；③探針設計、連接酶以及聚合酶的成本較高；④高通量檢測的優點并未完全發揮出來。

據此我們認為，RCA 檢測病原微生物可在以下方面開展相關工作：①簡化前處理步驟。目前水煮法［46］和自動化［47］提取核酸這種簡化方式為RCA 用于病原微生物的現場檢測提供了條件。②結合可視化技術［21］，比如通過與納米金、膠體金等聯用，使RCA 結果直接呈現，減少操作時間，結果更直觀，這是RCA 檢測規模化、標準化的基礎。③在探針設計、連接酶和聚合酶的選擇方面降低成本。如Nie等［44］以鎖式探針兩端檢測序列中間的連接序列為模板，特異性序列為引物合成探針來降低成本。④實現高通量檢測。鎖式探針的設計在保證中間連接序列不變的前提下，針對不同目標序列設計不同的捕捉序列，用一對引物擴增多種探針，以達到高通量檢測［37］的目的。

RCA 技術是一項便捷、靈敏、特異性強的快速檢測基因技術，繼續完善將使RCA 技術在病原微生物的檢測領域產生極大作用，同時也為新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）的快速檢測提供思路和補充。