安徽合肥地區2018—2019年犬細小病毒遺傳進化分析

姬凱元， 邱月陽， 程 敖， 蔣書東， 彭夢玲

(安徽農業大學 安徽省畜禽遺傳資源保護與生物育種重點實驗室，安徽 合肥 230036)

犬細小病毒(Canineparvovirus，CPV)屬于細小病毒科(Parvoviridae)，細小病毒亞科(Parvovirinae)，原細小病毒屬(Protoparvovirus)[1]，可引起犬急性出血性腸炎和幼犬心肌炎。雖然CPV是DNA病毒，但其顯示出與RNA病毒相似的高突變率，VP2基因每年每個位點的替換量約為10-4[2]。自1978年在美國首次報道原始CPV-2亞型以來，在世界范圍內相繼發現CPV-2a[3]、CPV-2b[4]、CPV-2c[5]、New-CPV-2a[6]、New-CPV-2b[7]、CPV-2c(a)[6]和CPV-2c(b)[6]等8種亞型。

CPV是一種沒有包膜結構的單股線狀DNA病毒，基因組全長5.3 kb，包括兩個主要開放閱讀框(open reading frame，ORF)[1]。ORF1編碼非結構蛋白(NS1 和 NS2)，其中，NS1是一種多效性核磷蛋白，主要誘導機體細胞凋亡，對于病毒在機體內的復制至關重要[8]；ORF2主要編碼衣殼蛋白(VP1和VP2)，VP2作為主要的結構蛋白，決定CPV的組織嗜性和宿主范圍[9]；兩側為非編碼區(untranslated region，UTR)。流行病學調查發現，目前國內流行株主要以New-CPV-2a、New-CPV-2b和CPV-2c為主[10-12]。為了解近年安徽地區CPV的遺傳變異情況，本研究通過采集2018—2019年安徽地區動物醫院疑似犬細小病毒感染犬糞便或肛門拭子，提取的DNA進行鑒定并隨機選取10株進行全基因組序列分析，了解安徽地區犬細小病毒主要亞型和遺傳變異情況，期望為CPV的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料的收集

采集2018—2019年安徽部分地區(合肥市區、長豐縣、馬鞍山市)動物醫院具有犬細小病毒感染癥狀的疑似病例糞便53份(合肥市區28份，命名為AHhf 1-28；長豐縣7份，命名為AHcf 1-7；馬鞍山市18份，命名為AHmas 1-18)。

1.2 主要試劑

pMD TM 19-T載體、DL2000 DNA Marker、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、PrimeSTAR MAX聚合酶、EsTaq聚合酶、質粒小提試劑盒、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態細胞。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank中CPV-SH1516株(MG013488)基因序列，采用Primer Premier 5設計CPV鑒定引物(CPV-F/R)和3對特異性引物(C1-F/R-C3-F/R)用于擴增中間片段；參照Han等[11]和Yu等[13]的方法設計特異性引物Y1、Y2，U1、U2分別用于擴增CPV 3′端的Y型發夾結構和5′端的U型發夾結構。引物由通用生物系統有限公司合成(表1)。

表1 鑒定與全基因組序列擴增引物

1.4 CPV基因組DNA提取與鑒定

DNA提取試劑提取樣品DNA，具體步驟按說明書進行。以提取的DNA作為模板進行PCR檢測，反應體系：2×TaqPlus MasterMix(Dye)DNA聚合酶5 μL、CPV-F/R各0.5 μL、DNA模板1 μL，ddH2O補足至10 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、35個循環；72 ℃ 10 min。1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產物，南京擎科生物科技有限公司測序。

1.5 CPV分型鑒定

為鑒定安徽地區31組陽性病料感染CPV所屬亞型，PCR法擴增CPV的VP2基因序列，根據測序結果鑒定合肥地區流行毒株的所屬亞型。

1.6 CPV全基因組擴增與結構分析

根據PCR鑒定結果，隨機選擇10株CPV陽性樣品，采用表1引物分7段擴增CPV全基因組。使用DNAStar軟件對擴增的7段CPV基因片段進行拼接，獲得完整的CPV序列，分析CPV的基因結構。

1.7 CPV遺傳進化分析

使用MEGA 6.0軟件分析安徽10株CPV與NCBI中28株CPV參考株(表2)的遺傳進化特點，繪制遺傳進化樹。根據序列特點分析NS1基因和VP2基因在遺傳進化分支中是否同步，初步探究CPV在進化的過程中是否涉及基因重組現象。

表2 CPV-2參考毒株

2 結果與分析

2.1 CPV的PCR鑒定結果

PCR鑒定結果顯示，53份待檢樣品中，有31份樣品擴增出約1 031 bp大小的單一條帶(隨機選8株結果進行展示，如圖1所示)，測序檢測確定為CPV陽性樣品。

2.2 CPV分型鑒定

31份陽性樣品CPV-VP2氨基酸序列分析發現，4株VP2第297位氨基酸為Ala，且426位為Asn，屬于New CPV-2a，占總體12.90%；1株第297位氨基酸為Ala，且426位為Asp，屬于New CPV-2b，所占比例為3.23%；27株第297位氨基酸為Ala，且426位為Glu，屬于CPV-2c，占絕對優勢，比例為83.87%(表3)。綜上可見，安徽地區以CPV-2c為主要流行毒株。

表3 CPV安徽分離株關鍵氨基酸位點信息

2.3 CPV全基因組測序結果

以AHhf1擴增結果為例，7對特異性引物均可擴增出單一的核酸片段，且大小與預期一致(圖2)。測序分析發現，7段擴增產物均為CPV片段。

2.4 CPV基因組結構分析

使用DNAStar軟件拼接10株CPV測序數據，獲得10株完整的CPV序列。分析發現，安徽地區分離的10株CPV的基因組序列長度在5 055～5 061 bp，長度存在一定差異。ORF1和ORF2分別編碼主要的非結構蛋白(NS1、NS2)和結構蛋白(VP1、VP2)，10株CPV的編碼區長度相同；3′UTR長度相同，均為269 bp，Y型回文結構長度均為120 bp；5′UTR長度為516～522 bp不等，U型回文結構長度為193～199 bp(表4)，由此可見，10株CPV基因序列長度差異主要是5′UTR核苷酸的突變、插入和缺失造成。

表4 10株CPV安徽株基因組結構分析

2.5 遺傳進化分析

基因組遺傳進化分析發現，38株CPV分為兩個進化分支，其中，亞洲地區流行的24株(22株中國株、1株越南株和1株泰國株)形成一個單系群，而國外株(包括歐洲、美洲和大洋洲共14株)形成另一個單系群(圖3)。在中國株的單系群中，又可分為兩個進化分支，安徽地區分離的10株CPV和其他14株CPV均起源于CPV-2aB004(EF011664)和CPV-LZ1(JQ268283)兩株，合肥地區流行的CPV主要以CPV-2c亞型為主，正在形成一個獨立的分支。NS1和VP2基因遺傳進化樹顯示，同一進化分支中，NS1和VP2基因遺傳進化樹之間不完全相同(圖4、圖5)。對于病毒而言，表面抗原(VP)和內部抗原(NS)所經歷的選擇壓力不同，為逃避宿主的免疫監視，CPV的表面抗原突變的頻率會顯著高于內部抗原[14]，因此VP2的變異比NS1發生得更快。同時，NS1和VP2基因在遺傳進化分支中的不同步現象，也為CPV的重組提供了依據。

2.6 VP2抗原突變特征

氨基酸差異分析發現，安徽地區分離的6株CPV-2c毒株(AHhf1、AHcf4、AHhf1、ANhf7、AHhf27、AHhf28)的VP2蛋白與表2中CPV-2c參考毒株同源性高，沒有發生特異性的突變；安徽地區分離的3株NEW-CPV-2a(AHmas2、AHmas16、AHmas17)與表2中11株NEW-CPV-2a參考毒株相比，AHmas2的VP2蛋白存在4個新的氨基酸突變位點(第5位氨基酸由Asn突變為Gly，第13位氨基酸由Pro突變為Ser，第370位氨基酸由Gln突變為Arg，第426位氨基酸由Asn突變為Glu)；安徽地區分離的1株NEW-CPV-2b與表2中4株NEW-CPV-2b參考毒株相比，存在部分氨基酸位點的突變，具體位點見表5。這種新的突變表示合肥毒株在形成地方特色的同時，也在不斷地進化。但是這種突變是否引起VP2蛋白結構和功能的變化，還需要進一步研究。

3 討論

CPV 呈世界性分布，在中國和其他亞洲國家(包括韓國、泰國、日本、印度、蒙古[15]、越南[16]、老撾[17]等)以CPV-2a毒株為主要毒株，而許多歐洲、北美、拉丁美洲和非洲國家以CPV-2c毒株為主要流行毒株[18-20]。流行病學調查發現，2009—2015年，在中國北京[21]、河南[22]、甘肅[11]、黑龍江[6]、四川[23]和南京[24]等省份流行的CPV毒株以New CPV-2a為主，且有少量New CPV-2b。2016年至今，我國以CPV-2c毒株感染發病的比例在逐漸增加，CPV-2c和New CPV-2a在中國部分區域成為優勢毒株[25]。本研究對31株安徽地區分離的CPV分型發現，2018—2019年安徽地區流行的CPV主要以CPV-2c型(27/31株)為主。遺傳進化分析發現，安徽地區分離的CPV正在形成了遠離國外CPV-2分離株的單簇，這表明安徽地區流行的CPV主要毒株可能來源于原始CPV-2分離株，從而在中國地區進一步適應與進化，而不是直接自國外引入。

VP2蛋白作為構成CPV衣殼的主要成分，暴露于衣殼表面，決定病毒感染的宿主范圍、凝集血紅細胞等功能，是刺激機體產生中和抗體的主要抗原[9]。CP的防控主要以荷蘭英特威(Intervet)、美國輝瑞(Pfizer)、法國梅里亞(Merial)和美國富道(Fort Dog)等公司生產的CPV弱毒疫苗為主。調查發現，富道公司的CPV弱毒苗以CPV-2b毒株為疫苗株制備，其余公司的CPV弱毒苗都是以CPV-2為疫苗株制備。雖然有研究表明，疫苗株為CPV-2和CPV-2b的CPV疫苗對CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c突變體具有保護作用[26]，但是由于VP2抗原的高突變頻率，可能導致CPV毒株的中和抗原表位發生變化，導致已接種CPV疫苗株的犬群感染CPV[27]。分析安徽地區10株CPV的VP2氨基酸序列特點發現，表2中11株NEW-CPV-2a參考毒株相比，安徽地區分離的部分NEW-CPV-2a毒株存在4個新的氨基酸突變位點(第5位氨基酸由Asn突變為Gly，第13位氨基酸由Pro突變為Ser，第370位氨基酸由Gln突變為Arg，第426位氨基酸由Asn突變為Glu)；安徽地區分離的1株NEW-CPV-2b與表2中4株NEW-CPV-2b參考毒株相比，存在部分氨基酸位點的突變(表5)。但是這種突變是否引起VP2蛋白結構和功能的變化，還需要進一步研究。

表5 VP2蛋白氨基酸突變位點統計表

由于成年犬和已免疫犬發生犬細小病毒感染的數量日趨增加，因此，加強本地區CPV的流行病學研究和遺傳進化分析具有重要意義。結合本研究和以往年份中國地區CPV亞型流行情況分析，CPV-2c已然成為安徽地區CPV-2的優勢毒株，同時CPV-New2a與CPV-New2b共同參與循環。期望本研究可以為CPV的研究提供參考。