急性顱腦損傷病人血清外泌體中泛素碳末端水解酶L1和神經絲蛋白輕鏈多肽的表達及意義

徐正芹 李楊 劉汪旺 葉柳

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)致殘率亦高。對于TBI病人的評估，除影像學以外，尋找TBI損傷相關生物標志物是研究熱點。泛素碳末端水解酶L1(ubiquitin carboxy terminal hydrolases L1,UCH-L1)及神經絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)在TBI病人血清中表達升高，可反映TBI的損傷程度及進展情況[1-2]。外泌體是一種分泌的細胞外小泡，攜帶一系列脂質、蛋白質、DNA和RNA，外泌體可很容易地通過血腦屏障進入外周循環，顯示了在各種神經疾病中作為有效生物標志物的潛力[3]。我們檢測TBI病人外周血中外泌體UCH-L1及NF-L蛋白的表達，評估其對TBI損傷程度及預后的價值。

對象與方法

一、對象

2017年1月～2020年8月在我院就診的中、重度TBI病人94例(觀察組)，入院后常規行頭部CT檢查。同期健康體檢人群52例作為對照組。觀察組男53例，女41例，年齡18～65歲，平均年齡(45.1±11.2)歲，對照組男30例，女22例，年齡21～60歲，平均年齡(44.6±9.8)歲，兩組年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義。納入標準：(1)中、重度TBI病人，入院時格拉斯哥昏迷評分(GCS)≤12分；(2)同意參與本次研究。排除標準：年齡<18歲；入院時間距受傷時間>2小時；GCS=3或雙側瞳孔固定擴張；頭部CT提示無異常；合并有可能影響生物標志物濃度的其他神經系統疾病，如神經退行性疾病、中風史或腦血管事件等，或者懷孕。本研究獲得我院倫理委員會批準，經受試者知情同意后采集標本。

二、方法

1.標本處理：觀察組病人分別于受傷后2小時、12小時、24小時、48小時、72小時，各抽取外周血約5 ml。于室溫下4 000Xg離心10分鐘，立即放置于-80 ℃保存備用。對照組于入院后2小時、12小時、24小時、48小時、72小時各抽取外周血5 ml，血液樣本處理與觀察組相同。觀察組病人入院后完善相關檢查，如頭顱CT、影像學評估損傷程度，是否合并腦水腫及是否彌漫性軸索損傷或局灶性軸索損傷等。每例病人均按照顱腦外傷診治規范予以對癥處理。統計入院后1周內觀察組病人死亡人數。

2.外泌體中UCH-L1及NF-L蛋白的檢測：樣品取0.5 ml解凍，4 ℃、3 000Xg離心15分鐘以去除碎片。加入ExoQuick溶液(System Biosciences公司)，于4 ℃孵育1小時，1 500Xg離心30分鐘。離心后的上層清液用250 μl PBS重懸。使用Nanosight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(NanoSight)對樣品進行直徑(nm)和濃度分析。濃度測定后，每個樣品用哺乳動物蛋白提取試劑(M-PER，Thermo Scientific公司)裂解外泌體，采用蛋白酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)檢測UCH-L1(ab244963,abcam公司)和NF-L(ab272366,abcam公司)濃度。用BIO-RAD680型全自動酶標儀獲取讀數。

三、統計學方法

結果

1.兩組UCH-L1及NF-L蛋白濃度比較見圖1。對照組2～72小時過程中UCH-L1及NF-L蛋白濃度均無明顯變化，分別為(11.34±0.62)pg/ml及(1.23±0.37)pg/ml。觀察組病人于受傷后12小時開始，外周血外泌體中UCH-L1及NF-L蛋白濃度即出現升高，其中UCH-L1蛋白濃度于12小時達到高峰，后逐步下降，但各時間點均高于對照組，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與UCH-L1蛋白濃度變化不同，NF-L蛋白濃度逐漸升高，2小時、12小時、24小時、48小時、72小時NF-L蛋白濃度分別為(1.11±0.38)、(5.43±2.32)、(8.39±1.23)、(9.12±1.64)及(11.43±2.45)pg/ml，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 兩組外周血外泌體UCH-L1蛋白濃度變化比較

圖2 兩組外周血外泌體NF-L蛋白濃度變化比較

2.外泌體中UCH-L1及NF-L蛋白濃度與臨床特征的關系見表1及表2。結果表明，UCH-L1及NF-L蛋白濃度與年齡、性別及是否合并腦水腫均無關，UCH-L1與病灶是否彌漫性或局灶性亦無關，但NF-L能很好區分彌漫性損傷或局灶性損傷，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 觀察組外泌體中UCH-L1蛋白濃度與臨床特征的關系(pg/ml)

表2 觀察組外泌體中NF-L蛋白濃度與臨床特征的關系(pg/ml)

3.外泌體中UCH-L1蛋白對死亡預測的作用：觀察組94例有12例病人UCH-L1蛋白的濃度變化與其他82例明顯不同，呈持續升高趨勢，而其他82例病人UCH-L1蛋白濃度于12小時達到高峰后即逐步下降，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。此12例病人均于入院后1周內死亡，余82例未出現死亡。說明外泌體中UCH-L1蛋白可以預測TBI病人早期死亡率。

圖3 觀察組不同預后病人UCH-L1濃度變化比較

討論

影像學檢查在評估TBI病情中具有重要作用，如顱腦CT、普通核磁共振以及磁共振彌散張量成像(DTI)等，前兩種檢查敏感性不高，后者為評估創傷性軸索損傷的有效手段，但成本較高，且要求繁瑣的圖像后處理。尋找可用于預測TBI嚴重程度以及預后的生物標志物，正成為研究的熱點[4]。除血清等傳統來源的標志物之外，外泌體的研究也受到關注。

外泌體是一種細胞外囊泡，廣泛存在于血液、腦脊液等各種體液中，可以攜帶來源細胞的信息，包括蛋白質、脂質、DNA及RNA等，進行細胞間信號傳導，參與各種重要的生理功能[5]。比如，在神經元及膠質細胞之間傳遞細胞介質，促進相互作用[6]。外泌體可以自由出入血腦屏障，這就為在外周循環中檢測中樞系統來源外泌體提供了可能。本研究表明，中、重度TBI病人發病早期，外周血外泌體中UCH-L1及NF-L升高，與對照組比較有明顯差異；同時，NF-L可以區分彌漫性或局灶性軸索損傷，UCH-L1可以預測發病早期死亡率。

UCH-L1是一種半胱氨酸泛素蛋白水解酶，特異性地存在于神經元中，曾被用作神經元的組織學標志物。UCH-L1在清除神經元中過量或錯誤折疊的蛋白質過程中發揮重要作用[7]。神經絲蛋白(NF)是神經元細胞骨架的重要組成部分。研究表明，UCH-L1及NF-L 均在不少種類的神經退行性疾病中參與了其發病過程[8]。有研究證實，在TBI發病后，血清中UCH-L1及NF-L水平升高，這兩種蛋白可以作為TBI潛在的生物標志物[9]。本研究結果表明，在中、重度TBI病人發病早期，外周血外泌體中UCH-L1及NF-L升高，UCH-L1蛋白濃度于12小時達到高峰，后逐步下降，但各時間點均明顯高于對照組相應數值，而NF-L蛋白濃度呈持續升高，兩者分別與對照組比較，差異均有統計學意義。說明中、重度TBI病人外周血外泌體中UCH-L1及NF-L有可能成為有價值的生物標志物。本研究還發現，NF-L可以很好地區分彌漫性或局灶性軸索損傷，UCH-L1可以預測發病早期死亡率。

彌漫性軸索損傷(diffusion axonal injury,DAI)是TBI病人的主要神經病理改變，主要是由于外力致頭部短時間內突然加速及減速，腦白質軸索纖維受到拉伸和剪切力，從而引起軸索的破壞和斷開[10]。傳統的神經影像學如CT及MRI敏感性低，而DTI技術仍不是臨床常規，效果仍有待觀察。AI等[11]及Pashtun等[12]研究指出，在受傷早期，血清NF-L 的濃度變化并不能反映DAI的嚴重程度。Johan等[13]研究指出，血清NF-L與DAI正相關，但Johan等的研究僅收集了9例病人，證據級別較低。這些研究結果說明，至少在目前看來，血清NF-L水平尚不能很好地反映DAI。我們的結果證實外周血外泌體NF-L水平能很好地區分彌漫性或局灶性軸索損傷，是反映DAI的敏感指標。之所以出現血清與外泌體中NF-L濃度與DAI之間關系的不一致，我們分析，可能是由于外泌體由受損神經元細胞或膠質分泌，通過血腦屏障進入外周循環，其包膜結構能很好地保護外泌體內物質的完整性，所以外泌體內NF-L蛋白濃度能較真實地反映腦損傷的程度。而外周血NF-L的濃度受較多因素的影響，比如可能受外周循環其他細胞因子的調控，以維持NF-L濃度在體內的平衡，這樣外周血血清中NF-L蛋白的濃度就不一定能反映真實的腦損傷情況。當然，具體的相關機制，仍有待于進一步研究。

我們的研究結果還顯示，在94例TBI觀察組病人中，外泌體UCH-L1蛋白濃度整體上呈現升高后再下降的趨勢，但其中有12例病人UCH-L1蛋白的濃度變化與其他82例明顯不同，是呈持續升高趨勢，這12例病人均于入院后1周內死亡，可以用以幫助鑒別出受傷后早期可能出現死亡的病人，采用不同治療手段干預。

本研究也存在局限。樣本量較小，外泌體中UCH-L1蛋白表達的差異情況是普遍規律還是個別現象，外泌體中NF-L濃度與DAI之間的關系，仍有待于更大規模的臨床研究來進一步證實