甘氨酸甲基轉移酶在肺癌及癌旁組織中的表達及臨床意義

孫臨奧 李昌盛 周雪峰

甘氨酸甲基轉移酶(glycine N-methytransferase，GNMT)是調節生物甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的肝臟甲基轉移酶[1]，在多種癌癥中有抑制癌細胞增殖的作用[2]。GNMT的缺失在肝癌的發生發展中起著重要的作用[3]。GNMT同樣也被作為前列腺癌的潛在生物標志物[4]。我們對GNMT在肺癌中的作用以及對病人預后評估作用進行研究。

對象與方法

一、對象

2015年6月～2020年6月間我院胸心血管外科收治的肺癌及癌旁組織標本140對，病人平均年齡54.47歲(34～78歲)，男79例，女61例。入組標準：(1)術前未行新輔助治療；(2)簽署手術知情同意書及標本獲取知情同意書；(3)由兩名以上病理醫師做出診斷。TNM分期采用IASLC第八版肺癌分期。均行手術治療，并經病理檢查診斷為肺腺癌 117例，鱗癌 23例。有吸煙史101例，無吸煙史39例，年齡≤55歲63例，年齡>55歲77例。伴有淋巴結轉移31例，不伴淋巴結轉移109例。腫塊直徑≥3 cm 48例，腫塊直徑<3 cm 92例。TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別為55例、58例和27例。腫瘤高、中、低分化分別為58例、45例和37例。術后所有病人分別隨訪6～60個月。

二、方法

1.全部癌旁組織標本均取自于離腫瘤>3 cm處。自病歷系統中獲取性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、分化程度等臨床特征，分析GNMT表達與肺癌病人臨床病理特征及預后的關系。

2.實驗方法：(1)逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)：所有組織標本離體后立即用液氮罐收集并儲存于-80 ℃冰箱中。采用TRIzol提取總RNA，用QuantiFast RT-PCR試劑盒反轉錄成cDNA，QuantiTect-SYBR-Green-PCR檢測Dock10的表達。GAPDH作為內參。GNMT引物序列為：5′-ATGCTGTCATCTGCCTTGGAAAC-3′和5′-GCCTGTACTGAGGATGTGGTCGT-3′，GAPDH序列為：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′和5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。(2)蛋白免疫印跡實驗(Western-blotting)：使用RIPA裂解液提取組織總蛋白，用10%SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移至PVDF膜。用5%無脂牛奶在TBST中封閉膜30分鐘，然后加入相應的一抗GAPDH(Proteintech，貨號：10494-1-AP)及GNMT(Proteintech，貨號：18790-1-AP)4 ℃下孵育過夜。在TBST中洗滌3次，每次5分鐘后，在室溫下用2.5%脫脂乳在TBST中與二抗孵育膜1小時。每張膜滴加適量的ECL底物，孵育數分鐘后X光膠片壓片后。放入顯影液及定影液中顯影及定影。(3)酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)：使用GNMT ELISA試劑盒，并依照試劑盒說明，準備試劑，樣品及標準樣品。加入樣品或標準樣品至每個孔中，于37 ℃條件下，孵育2小時,加入試劑A，再次于37 ℃條件下，孵育1小時,吸出反應液后重復洗3次，再加入試劑B，于37 ℃條件下，孵育30分鐘,吸出反應液后反復洗5次，在加入90 μl反應底物后于37 ℃條件下，孵育20分鐘，加入50 μl終止液，于450 nm波長分光光度儀器檢測吸光值，以空白對照孔調零后測各孔OD值。

三、統計學方法

結果

1.肺癌和癌旁組織中GNMT mRNA與蛋白的表達水平：利用RT-qPCR和Western-blot法來檢測肺癌及癌旁組織中的GNMT mRNA與蛋白的表達水平。結果顯示，肺癌組織(T)中GNMT mRNA表達水平低于癌旁組織(N)。癌旁組織GNMT蛋白表達水平高于癌組織(圖1)。圖中列出3例典型癌與癌旁組織GNMT表達情況，其余137對標本癌旁組織GNMT蛋白表達水平不同程度的高于癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

T表示癌組織，N表示癌旁組織

2.肺癌和癌旁組織中GNMT的表達量：用ELISA檢測肺癌及癌旁組織中的GNMT表達，肺癌組織中GNMT表達的平均值為(632.21±19.43)ng/ml，癌旁組織中GNMT表達的平均值為(503.17±22.61)ng/ml。肺癌組織中的GNMT表達低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

3.GNMT在肺癌中的表達與臨床病理特征的關系見表1。進一步分析GNMT在肺癌中的表達與臨床病理特征的關系，結果顯示，GNMT高表達與淋巴結轉移、腫瘤大小、TNM分期顯著負相關，與腫瘤分化程度呈正相關(P<0.05)，與年齡、性別、吸煙史無關(P>0.05)。

表1 GNMT表達量與肺癌病人臨床病理特征的關系

4.GNMT表達與肺癌病人預后的關系見表2。肺癌病人癌組織內GNMT表達量高于平均值的為高表達，Kaplan-Meier法顯示，GNMT高表達病人的中位生存期為45個月，明顯高于GNMT低表達病人(34個月)(P<0.05)(圖2)。多因素Cox回歸分析顯示，肺癌病人生存期與性別、年齡、吸煙史無相關性，而與淋巴結轉移、TNM、分化程度、腫瘤大小以及GNMT表達相關(P<0.05)。因此，可以得出GNMT是肺癌的獨立預后因素。

表2 肺癌病人生存期相關的危險因素分析

圖2 GNMT不同表達水平肺癌病人生存分析

討論

肺癌是目前全球發病率最高的惡性腫瘤之一，肺癌的早期檢測及對肺癌病人的預后評估仍然缺乏有效的指標，對于肺癌病人的預后評估以及診斷手段的探索是臨床研究的熱點[5]。肺癌在臨床工作發現時多已是TNM分期較高[6]。在肺癌的發生和發展中，肺癌所在的微環境起著重要的作用，機體的酶與蛋白等其他化學物質在肺癌的發生和發展中起重要作用[7]。控制肺癌發生、發展，評估肺癌預后的有效指標顯得尤為重要，尤其是多層次方面的控制與評估[8]。GNMT主要在惡性腫瘤中發揮作用，通過蛋白質在癌細胞中的瞬時表達誘導細胞凋亡，并導致ERK1/2的激活作為早期的抑制作用。GNMT的抗增殖作用可以通過用泛半胱氨酸蛋白酶抑制劑zVAD-fmk治療而部分逆轉。凋亡的誘導與GNMT核定位有關[9]。本研究分析GNMT與肺癌生物學特征以及與病人預后的關系。

本研究結果表明，肺癌組織中GNMT mRNA及蛋白水平低于癌旁組織。肺癌組織中GNMT表達量低于癌旁組織。隨著病人TNM分期的升高，病人肺癌組織中GNMT的表達也逐漸降低。這說明GNMT在肺癌中起抑制作用。有研究表明，在乳腺癌肺轉移病人中GNMT較其他部位轉移表達更低[10]，本研究中淋巴結轉移病人GNMT表達更低，說明GNMT在肺的惡性腫瘤中有抑制作用。GNMT基因敲除的小鼠中，肉瘤樣肝癌的發生率更高，癌組織增殖更快[11]，提示在肝癌中GNMT的抑癌作用十分明確。在肺癌中腫塊更大的病人GNMT的表達水平明顯降低。GNMT的升高預示著病人生存期延長。因此，GNMT在肺癌中的作用為抑癌作用并能預示病人的生存期。GNMT通過在高蛋氨酸或低S-腺苷甲硫氨酸(SAM)條件下產生肌氨酸來緩沖SAM水平，促進SAM分解代謝可延長果蠅的壽命[12]，這與我們分析的GNMT高表達的病人的生存期更長的結果是相符合的。

有研究表明，GNMT是原發性肝癌的腫瘤抑制因子，miR-224在原發性肝癌中充當促癌基因miRNA，含有GNMT編碼序列的miR-224結合位點沉默突變的GNMT-MT質?？梢蕴颖蹾EK293T細胞中miR-224的抑制。miR-224減弱了GNMT對抑制細胞增殖和腫瘤生長的影響[13]。GNMT參與甲基供應、DNA甲基化和核苷酸生物合成。它調節細胞S-腺苷甲硫氨酸與S-腺苷同型半胱氨酸的比率和S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉移反應。GNMT在快速生長的肝細胞癌中不表達，而在生長緩慢的肝癌中則呈低水平表達。GNMT通過與含有雷帕霉素(mTor)作用蛋白的Dep結構域相互作用來抑制肝細胞癌的生長。它支持嘧啶和嘌呤的合成，并最大限度地減少葉酸耗竭后尿嘧啶與DNA的結合。有研究表明，靶向細胞核的GNMT仍然發揮著強大的抗增殖作用[14]。在前列腺癌中，雄激素受體表達細胞中的GNMT表達受到雄激素的刺激，這種刺激發生在mRNA和蛋白質水平上，GNMT在與雄激素受體靶向結合后產生抑制前列腺癌的增殖作用[15]。GNMT所誘導產生的S-腺苷甲硫氨酸可以被作為一種化學預防劑對肝癌和其他形式的癌癥產生抑制作用[16]。在肺癌中，GNMT還與癌組織的病理形態有關系，低分化肺癌的GNMT表達水平明顯降低，說明分化程度越高GNMT表達越高。由此可見，GNMT在多種癌癥當中發揮著抑癌因子的作用。

在肺癌組織中，GNMT的表達量明顯低于癌旁組織中的表達量，分化程度越低、TNM分期越高的病人，GNMT的表達量越低，生存期越長的病人GNMT表達越高?？傊?，GNMT在肺癌中可能起著抑制腫瘤發生發展的作用，并能預測病人的預后。