甲狀腺乳頭狀癌病人血清微小RNA-451的檢測及其診斷價值的研究

馬靜 張楠 馬斌林

甲狀腺癌在全世界的發病率迅猛上升，甲狀腺乳頭狀癌是其中占比最多的病理類型。甲狀腺乳頭狀癌缺乏特征性的術前檢測標志物。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈小RNA分子，在多種人類疾病，包括癌癥中都表現出了功能異常或者表達異常[1]。miRNA-451位于17號染色體著絲粒附近，現有多項研究提示，miRNA-451在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈現低表達，且其表達的下調與甲狀腺乳頭狀癌的發生有關。但是關于血清miRNA-451與甲狀腺乳頭狀癌的關聯研究并不多見。本研究采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測了36例甲狀腺乳頭狀癌病人血清中miRNA-451的表達情況，分析了其表達與病人臨床病理特征之間的關系，意在了解檢測血清miRNA-451是否對甲狀腺乳頭狀癌的術前診斷有幫助。

對象與方法

一、對象

2019年4～ 5月在我院接受手術治療并且病理診斷明確的甲狀腺腫瘤病人73例為研究對象(術前抽取血清備用)。其中36例為甲狀腺乳頭狀癌病人，37例為甲狀腺良性腫瘤。36例甲狀腺乳頭狀癌病人中，男性7例，女性29例；平均年齡為(49.47±8.24)歲，其中≤55歲10例，>55歲26例；病灶位于單側的30例，雙側6例；單個病灶25例，多個病灶11例；無淋巴結轉移18例，有淋巴結轉移18例。

二、方法

1.材料：36例甲狀腺乳頭狀癌和37例甲狀腺良性腫瘤病人的血清樣本。

2.步驟：MiRcute Serum/Plasma miRNA Isolation Kit提取血漿總 RNA，采用反轉錄試劑miRNA First Strand cDNA Synthesis反轉錄獲得 cDNA。采用qRT-PCR 儀對 miR-451進行擴增。反應體系：正、反引物(10 μmol/l)各0.5 μl，聚合酶和綠色熒光染料的預混液5.0 μl，cDNA(50 ng/μl)1.0 μl，RT-PCR試劑盒中水3.0 μl，共10 μl。反應條件設置如下：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個循環。反應結束后，以miR-39為外參，采用 2-△△Ct法對miR-451a在不同血漿樣品中的相對表達量進行分析。

三、統計學方法

結果

1.甲狀腺乳頭狀癌及良性腫瘤病人血清微小RNA-451的表達情況：對甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性腫瘤病人的血清微小RNA-451表達量進行分析顯示，兩組血清微小RNA-451表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌病人血清中微小RNA-451表達量水平為(1.09±0.27)，良性腫瘤病人血清中微小RNA-451表達量水平為(1.31±0.23)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 血清miR-451在甲狀腺乳頭狀癌與良性腫瘤病人中的相對表達水平對比

2.甲狀腺乳頭狀癌病人血清微小RNA-451與臨床病理特征的關系：血清微小RNA-451的表達水平與甲狀腺乳頭狀癌病人臨床病理特征之間的關系：血清微小RNA-451的表達水平在有淋巴結轉移的病人中明顯低于無淋巴結轉移的病人(0.92±0.17 vs 1.28±0.22，P<0.05)，見表1。血清微小RNA-451的表達水平與甲狀腺乳頭狀癌病人的年齡、性別、病灶位置、病灶數目等臨床病理資料無關。

3.檢測血清miRNA-451對甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷價值：以甲狀腺良性腫瘤病人血清中miRNA-451表達量作為對照，制作受試者工作特征曲線(ROC曲線)，通過ROC曲線分析，血清微小RNA-451對診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.720(圖2)；在36例甲狀腺乳頭狀癌病人中，以淋巴結未轉移病人血清中的miRNA-451表達量作為對照，血清微小RNA-451對于判斷甲狀腺乳頭狀癌是否伴有淋巴結轉移的ROC曲線下面積是0.873(圖3)。

圖2 血清miR-451在甲狀腺乳頭狀癌與良性腫瘤病人中的相對表達水平的ROC曲線

圖3 血清miR-451在甲狀腺乳頭狀癌有無淋巴結轉移病人中相對表達水平的ROC曲線

討論

甲狀腺腫瘤的術前診斷主要依賴于超聲檢查，依據目前超聲診斷甲狀腺結節的TI-RADS分級診斷系統，其對4級以上結節的惡性可能性評估范圍跨度較大(5%～100%)[2]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型，其術前診斷的“金標準”是超聲引導下的細針穿刺細胞學檢查。但是細針穿刺細胞學的漏診因素較多，例如甲狀腺結節的大小、部位、距體表的距離及伴發的基礎疾病等[3]，且細針穿刺細胞學檢查屬于有創檢查，病人的配合度不盡相同。因此，甲狀腺乳頭狀癌的術前診斷缺乏特異性的無創檢測標志物。

miRNAs是細胞增殖、分化、凋亡和遷移的關鍵調控因子。miRNAs的異常表達與多種腫瘤的發生發展有關，包括不同類型的甲狀腺癌[4]，在已知的miRNA中，有的miRNA在甲狀腺癌組織中表現為下調，另一些表現為上調[5-6]。目前關于miRNAs與甲狀腺癌的研究多集中于病理組織標本，關于甲狀腺乳頭狀癌血清miRNAs檢測的研究并不多見，少數研究者對miRNA-221、miRNA-222、miRNA-455在甲狀腺乳頭狀癌病人血清檢測的意義做了研究[7]。

miRNA-451位于17號染色體著絲粒附近，現有的研究提示其在多種惡性腫瘤中呈低表達，如在肝癌，胃癌的體外研究提示miRNA-451的表達與這些腫瘤的侵襲性呈負相關[8-9]。目前關于miRNA-451在甲狀腺癌病理組織中的研究亦很多見，如Duan等[10]、Zhang等[11]檢測了miRNA-451在甲狀腺乳頭狀癌石蠟包埋組織中的表達，均發現其在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達較癌旁組織明顯為低，且后者的研究提示miRNA-451在淋巴結轉移病人中的表達較無轉移者低。李曉娜等[12]的研究也提示在甲狀腺癌組織中miRNA-451表達顯著低于癌旁組織，并分析了miRNA-451可通過靶向MIF抑制PI3K/Akt信號通路抑制K1甲狀腺癌細胞增殖及促進細胞凋亡的機制。

基于以上miRNA-451在甲狀腺癌病理組織中研究，本研究檢測了36例甲狀腺乳頭狀癌病人和37例甲狀腺良性腫瘤病人的血清中miRNA-451的表達情況，意在通過檢測甲狀腺乳頭狀癌病人血清中miRNA-451的表達，了解其是否可以在術前對甲狀腺乳頭狀癌的無創診斷提供幫助。本研究結果提示甲狀腺乳頭狀癌病人血清中miRNA-451的相對表達量明顯低于甲狀腺良性腫瘤病人的表達，并且在比較了miRNA-451與甲狀腺乳頭狀癌病人臨床病理資料的關系時發現miRNA-451在有淋巴結轉移病人中的表達量更低，這與上述研究者在甲狀腺乳頭狀癌石蠟包埋組織中的檢測結果一致；通過受試者工作曲線分析了血清miRNA-451對診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.720，表明檢測血清miRNA-451有助于區分甲狀腺疾病的良惡性，但是其診斷效能并不很理想；基于本研究中miRNA-451在甲狀腺乳頭狀癌有淋巴結轉移病人中的表達明顯低于其在無淋巴結轉移病人中的表達的實驗結果，我們分析了血清miRNA-451在判斷甲狀腺乳頭狀癌有否淋巴結轉移的ROC曲線下面積是0.873，說明檢測血清miRNA-451對于術前判斷甲狀腺乳頭狀癌病人淋巴結是否轉移有一定的診斷意義。

目前關于miRNA-451與甲狀腺乳頭狀癌關系的研究尚處于初步階段，雖然本研究提示甲狀腺乳頭狀癌病人的血清miRNA-451呈低表達，但仍需擴大樣本量進一步分析，并進一步探索血清中miRNA-451表達是否與組織標本中的表達完全一致，進而從機制上了解miRNA-451如何影響甲狀腺乳頭狀癌的發生發展。在目前甲狀腺癌仍然基于超聲及術前細胞學穿刺作為手術依據的情況之下，探索血清miRNA-451在診斷甲狀腺乳頭狀癌病人的表達節點，并在術前對淋巴結是否有轉移做出預判有一定的研究意義，期待miRNA-451血清檢測能夠為甲狀腺乳頭狀癌病人的術前診斷及淋巴結預判提供一種無創的檢測方法。