干制黃芪莖葉對SD大鼠致畸性研究

李慧，崔瑩，馬德志，張可勇，李靜輝，劉吉成

（齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

黃芪莖葉是豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］或膜莢黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.］的地上嫩莖和葉部分，作為中藥材黃芪的附加產品，長期被用于藥用和食用。黃芪莖葉的藥用記載最早見于魏晉時期陶弘景所著的《名醫別錄》，其中記載了黃芪莖葉的別名“芰草”以及其功能主治為“療渴及筋攣，癰腫，疽瘡”，后《本草正義》中注釋為“黃耆莖葉療渴，亦升清滋液之功。治筋攣者，亦稟溫和之性……與根之偏于補益者，固自有別耳”，表明黃芪莖葉與黃芪根的功效有所差異。

研究顯示黃芪莖葉中含有多種生物活性成分。張艷等［1］對黃芪莖葉中的主要成分及營養成分進行分析，結果顯示黃芪莖葉中總皂苷含量為23.35 mg/g，多糖含量為27.04 mg/g，黃酮含量為5.61 mg/g，且微量元素含量與根部含量接近，具有藥物與營養的雙重價值。黎映瓊等［2］對不同產地黃芪根、莖、葉中的4 種異黃酮成分進行了含量比較，結果表明不同部位四種成分含量差異較大，其中芒柄花苷和芒柄花素在莖葉中的積累量高于根中，這為后續黃芪莖葉的開發利用奠定了基礎。程合理［3］采用HPLC－ELSD 的方法測定了黃芪根和莖葉中黃芪甲苷的含量，結果顯示黃芪莖葉中黃芪甲苷的含量明顯高于黃芪根。目前，黃芪莖葉的成分已較為明確，相關研究也受到了廣泛的關注［4－7］，且有藥理學研究顯示，黃芪莖葉具有良好的抗衰老、抗炎、保護肝臟、保護心血管和抗氧化等作用［8－11］。

除藥用外，其食用歷史也有600年之久，在明代《救荒本草》《野菜博錄》《本草綱目》中均有其食用方法的記載，如：“黃芪莖葉食法，采嫩苗葉煠熟，換水浸淘去苦味，油鹽調食”。隨著人們健康意識的不斷提升，越來越多的人將黃芪莖葉作為健康食品的重要原料，尤其在我國黑龍江大興安嶺、內蒙古等地多見。

作為有廣泛應用前景的天然綠色原料之一，目前對其致畸性等毒理學的研究相對較少。因此，開展黃芪莖葉致畸性試驗對黃芪莖葉的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 原料

試驗樣品為蒙古黃芪與膜莢黃芪的地上部分，采收后自然晾干。采用熱回流提取濃縮裝置對樣品進行提取，料液比1∶15，加水浸泡30 min，微沸條件下提取5 h（分2 次，每次2.5 h），提取后的殘渣加入75%的乙醇提取4 h（分2次，每次2 h），最終將過濾液合并。

合并后的濾液采用噴霧干燥塔直接干燥為粉末，條件為180 ℃，流速2 L/h，負壓0.04 Mpa。

1.2 試驗動物

清潔級的健康SD 雌性大鼠180 只，雄性30 只，體質量（200±20）g，生產許可證號和使用許可證號分別為SCXK（浙）2014－0001 和SYXK（浙）2011－0166。飼養環境室溫為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%，于不銹鋼籠中飼養。

1.3 試驗方法

1.3.1 劑量和分組

根據預實驗急性毒性實驗結果（包括最大可灌胃濃度和灌胃體積）設置干制黃芪莖葉低、中、高三個劑量組的給藥劑量分別為3.75、7.50、15.00 g/kg，陰性對照組給予蒸餾水。按照前期樣品提取率分別稱取樣品9、18、36 g，各加300 mL蒸餾水混勻，4 ℃冰箱保存。

雌、雄大鼠同籠的比例為2∶1，以次日早晨陰道涂片是否見精子作為是否受精的評判指標。隨后將受精鼠隨機分為4 組，并記錄體質量，受精當天確定為受孕第0天，每組不少于16只。

1.3.2 試驗方法及觀察指標

在受孕的第6～15 天，每天上午按劑量給予各組大鼠相應受試物，并于受孕的第0、6、9、12、15、20 天記錄體質量。于第20 天將母鼠處死，取出子宮稱重，并檢查記錄黃體數、活胎數、吸收胎及死胎數。逐個記錄活胎鼠的體長、尾長、性別以及體質量，觀察是否有畸形發生。將每窩胎鼠的一半浸入95%乙醇中固定3 周，淋洗后用2%氫氧化鉀處理3 d，后浸入茜紅素染色，透明后觀察骨骼是否發生畸形；另一半浸入Bouins溶液，以備觀察內臟是否發生畸形。

1.4 統計學分析

所有數據采用SPSS 13.0 軟件進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計量資料采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，P＜0.05 代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 干制黃芪莖葉對孕鼠一般情況及體質量增長情況的影響

試驗過程中所有孕鼠均未見異常情況，體質量增加正常，未見中毒現象，無死亡。低、中、高劑量組孕鼠體質量增長狀況良好，與陰性對照組比較，受孕大鼠各時期的體質量變化差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 干制黃芪莖葉對孕鼠體質量增長情況的影響（±s）

表1 干制黃芪莖葉對孕鼠體質量增長情況的影響（±s）

組別陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組受精鼠（n）20 20 20 20受孕鼠（n）16 17 16 16體質量（g）第0天187.0±9.5 186.7±11.3 187.0±9.6 186.7±12.3第6天225.6±11.1 222.0±11.6 223.8±10.1 223.2±11.8凈增重（g）38.0±8.7 36.7±9.4 30.9±11.7 38.1±7.7第9天241.7±8.3 238.6±11.3 237.8±11.3 242.1±13.4第12天259.0±9.1 251.8±12.3 254.5±13.1 254.6±16.9第15天274.6±8.5 269.7±12.9 269.8±16.6 273.9±16.0第20天329.7±11.4 318.1±22.0 321.1±15.0 328.2±21.4增重（g）104.1±12.3 96.1±18.4 96.0±13.3 105.0±16.0

2.2 干制黃芪莖葉對孕鼠生殖功能的影響

與陰性對照組比較，低、中、高劑量組孕鼠的著床、吸收胎等生殖功能的代表性指標差異均無統計學意義（P＞0.05），表明干制黃芪莖葉對孕鼠的生殖功能未產生損害性作用。見表2。

表2 干制黃芪莖葉對孕鼠生殖功能的影響

2.3 干制黃芪莖葉對胎鼠的影響

2.3.1 對胎鼠生長發育的影響

與陰性對照組比較，低、中、高劑量組受檢胎鼠的身長、尾長、體質量和性別比指標差異均無統計學意義（P＞0.05），表明干制黃芪莖葉對胎鼠的生長發育無影響。見表3。

表3 干制黃芪莖葉對胎鼠生長發育的影響（±s）

表3 干制黃芪莖葉對胎鼠生長發育的影響（±s）

組別陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組檢查胎鼠數（n）171 167 170 172身長（cm）3.68±0.11 3.69±0.09 3.68±0.08 3.70±0.05尾長（cm）1.48±0.04 1.50±0.06 1.49±0.06 1.48±0.07體質量（g）3.89±0.23 3.89±0.28 3.92±0.25 3.97±0.16雄∶雌1∶1.10 1∶0.97 1∶0.98 1∶0.96

2.3.2 對胎鼠畸變的影響

低、中、高劑量組與陰性對照組胎鼠均無外觀畸形，表明在胎鼠發育過程中，用干制黃芪莖葉飼喂孕鼠不會引起胎鼠外觀畸形的發生。見表4。所有組別均觀察到少數胎鼠的胸骨發生缺失以及囟門增大現象，但經與陰性對照組數據進行統計學分析，結果顯示差異無統計學意義（P＞0.05），表明干制黃芪莖葉不會引起胎鼠骨骼畸形的發生。見表5。內臟觀察顯示，低、中、高劑量組與陰性對照組胎鼠均無內臟畸形的發生（P＞0.05）。見表6。

表4 干制黃芪莖葉對胎鼠外觀畸形的影響

表5 干制黃芪莖葉對胎鼠骨骼畸形的影響

表6 干制黃芪莖葉對胎鼠內臟畸形的影響

3 討論

黃芪莖葉的藥用和食用歷史悠久，近年來，關于黃芪莖葉的基礎研究大多集中在主要成分、藥理作用等方面。雖然黃芪莖葉在醫療保健方面的作用已得到廣泛認可，但相關的毒理學實驗數據和支持資料較少，尤其是關于致畸的研究。在已報道的文獻中，PARK等［12］對黃芪莖葉喂養90 d 的小鼠進行了試驗研究，結果顯示劑量為5 000 mg/kg 時仍未見毒性；宮新城等［13］用黃芪莖葉煎劑浸料飼喂懷孕6 d的小鼠，結果表明在飼料中加入黃芪莖葉可以明顯提高仔鼠的出生體質量和生長速度，后代體質明顯好于對照組。李永［14］對黃芪茯苓制劑灌胃大鼠后的生殖毒性和胚胎致畸性進行了觀察，結果顯示復方黃芪茯苓制劑無明顯致畸作用。朱玉平等［15］研究了黃芪甲苷對SD大鼠的致畸作用，結果表明黃芪甲苷在1.0 mg/kg 劑量時對SD 大鼠有一定母體毒性和胚胎毒性，但在受試劑量下無胎兒毒性，也無明顯的致畸作用。孫建琴等［16］對黃芪復方營養液進行了大鼠致畸試驗，結果顯示該營養液對孕鼠無母體毒性、胚胎毒性和致畸作用。朱江波等［17］研究了黃芪甲苷對大鼠和兔的生殖毒性作用，表明了黃芪甲苷在1.0 mg/kg 條件下對兔有胚胎毒性，無致畸作用。丁伯良等［18］利用膜莢黃芪莖葉粉進行小鼠毒性反應試驗，結果顯示日糧中搭配20%的莖葉粉時，小鼠于第32天中毒死亡，中毒癥狀類似瘋草中毒。然而多篇文獻報道，蒙古黃芪和膜莢黃芪莖葉中并不含有可導致中毒的物質，其產生的結果可能是由于實驗時給小鼠誤服了黃芪屬中其他形態上類似于膜莢黃芪的有毒植物［19］。本研究在試驗劑量下未見大鼠母體毒性和致畸作用，與現有研究成果結果類似，但結合既往相關研究來看，仍需在一定程度上嚴格把控使用劑量。

隨著人們生活健康水平的提升，天然的食療保健產品逐漸受到更多的關注，在這種形勢下，科學合理地綜合開發富含生物活性有效成分、氨基酸、維生素的黃芪莖葉，使人們通過膳食方式提升免疫力，促進身體健康，具有重要和深遠的社會意義。天然植物原料的致畸試驗是指通過觀察該原料在動物母體吸收后對胚胎的正常發育和器官形成的影響作用，對該原料作為食品應用的安全性進行評價。本實驗中將干制黃芪莖葉提取物用于大鼠致畸試驗，受孕大鼠無中毒現象發生，對大鼠的體質量、受孕情況、活胎/吸收胎/死胎率和平均活胎數等均無顯著影響；對胎鼠骨骼畸形和內臟畸形的發生均無明顯影響。低、中、高劑量組胎鼠的體質量、身長和尾長等與陰性對照組之間均無顯著差異。