雙光子熒光顯微系統(tǒng)中波前像差對三維點擴散函數(shù)的影響

靳 程，孔令杰

(清華大學 精密儀器系，北京 100084)

憑借穿透深度深、低漂白、三維可分辨等優(yōu)勢，雙光子熒光顯微系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于在體生物動態(tài)成像領(lǐng)域，并極大地推動了神經(jīng)科學、免疫科學等生物醫(yī)學的研究[1-3]. 但是由于生物組織的非均勻性、各向異性等固有屬性，光在生物組織中傳輸時將經(jīng)歷隨機折射與散射，產(chǎn)生波前像差(樣本像差)，從而降低顯微成像質(zhì)量. 此外，考慮到實際成像系統(tǒng)還存在光學元件加工與裝配誤差、樣品放置不當?shù)纫蛩匾鸬南到y(tǒng)像差，因此成像質(zhì)量將會進一步受到影響[4-5]. 波前像差會造成衍射極限點擴散函數(shù)的畸變，從而會降低成像分辨率和對比度，甚至會導致圖像產(chǎn)生偽影，進而造成生物結(jié)構(gòu)圖像的誤判. 因此了解波前像差對光學顯微成像質(zhì)量的影響，在生物醫(yī)學成像中尤為重要.

與單光子熒光顯微技術(shù)不同，雙光子熒光顯微技術(shù)基于雙光子吸收效應(yīng)實現(xiàn)了局域激發(fā)(即熒光信號僅在激發(fā)焦點附近產(chǎn)生)[6]. 雙光子熒光顯微技術(shù)通常采用點掃描方式對樣本進行逐點激發(fā)成像，在每次激發(fā)下，無論樣本是否經(jīng)歷散射或隨機折射，系統(tǒng)收集的所有發(fā)射熒光均作為該點對應(yīng)的樣本熒光信號. 因此，雙光子熒光顯微成像引入的像差是指激發(fā)端光路引入的像差，此時波前像差所造成的激發(fā)光三維點擴散函數(shù)的畸變將嚴重影響激發(fā)效率及成像質(zhì)量[5].

本文結(jié)合清華大學“神經(jīng)光子學”課程的教學實踐[7]，詳細介紹了波前像差及其對雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的影響. 首先，系統(tǒng)介紹了波前像差的數(shù)學表達形式；然后，使用矢量仿真模型，對像差影響下的雙光子熒光顯微系統(tǒng)的三維點擴散函數(shù)進行了數(shù)值仿真；最后，在雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)中，對三維點擴散函數(shù)畸變進行了實驗觀測，進一步說明了像差的不利影響和像差校正的必要性. 同時，還討論了如何設(shè)計教學方案，以引導學生加深對波前像差及其影響的認識.

1 波前像差的數(shù)學描述

像差影響著光學系統(tǒng)成像質(zhì)量. 為便于量化像差造成的影響，通常采用波前像差(即實際波面與理想波面之間的光程差)研究像質(zhì)評價問題[2]. 其中，澤尼克圓多項式被廣泛應(yīng)用于波前像差的表征. 澤尼克圓多項式一般用下式定義[8]：

(1)

其中，

一般地，像差引入的相位偏移量可以表示為

圖1 各澤尼克模式所描述的波前像差分布

2 波前像差造成雙光子熒光顯微中點擴散函數(shù)畸變的數(shù)值仿真

點擴散函數(shù)即光學系統(tǒng)的脈沖響應(yīng)函數(shù). 光學系統(tǒng)所成的像，可理解為物像與點擴散函數(shù)的卷積[4]. 因此可通過分析點擴散函數(shù)畸變來評價像差對成像質(zhì)量的影響. 考慮到雙光子熒光顯微等非線性光學顯微成像需使用高數(shù)值孔徑的物鏡以提高激發(fā)效率，可采用矢量衍射理論來描述焦點附近的電場分布[9]. 衍射積分公式可以寫成：

(2)

其中E(x1,y1,z1)表示點(x1,y1,z1)處的電場分布，C是歸一化常量，α是取決于物鏡數(shù)值孔徑的光束最大所張成的半角大小，A(θ,φ)是入射光束的振幅分布，B(θ,φ)是切趾因子，P(θ,φ)描述激發(fā)光束的偏振態(tài)對矢量場的影響，M(θ,φ)指波前像差. 經(jīng)物鏡聚焦的入射光的點擴散函數(shù)可以表示為

hex(x1,y1,z1)=|Ex|2+|Ey|2+|Ez|2.

(3)

在雙光子熒光顯微成像中，實際的有效激發(fā)點擴散函數(shù)是入射光點擴散函數(shù)的平方，可以表示為

(4)

在仿真中，選擇x方向偏振的理想平面波作為激發(fā)光束，其波長為920 nm，同時選擇數(shù)值孔徑為0.8的水浸物鏡.

圖2 各澤尼克模式所對應(yīng)像差引起的三維點擴散函數(shù)畸變

3 波前像差造成雙光子熒光顯微中點擴散函數(shù)畸變的實驗研究

雙光子熒光顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意如圖3所示. 摻鈦藍寶石激光器產(chǎn)生的飛秒脈沖(～120 fs)，經(jīng)過透鏡L1和L2構(gòu)成的4f系統(tǒng)進行擴束，使擴束后的光斑尺寸與靈敏電流計振鏡(GM1和GM2)的靶面尺寸匹配. 激發(fā)光經(jīng)過靈敏電流計振鏡后再經(jīng)過掃描透鏡(SL)、管透鏡(TL)、二向色鏡(DM)和物鏡(OL)到達樣本面，即可在焦點處產(chǎn)生雙光子吸收. 所激發(fā)出的雙光子熒光信號會被物鏡反向收集，再經(jīng)過二向色鏡、透鏡L3、濾波片(F)后被光電倍增管(PMT)探測，即得到對應(yīng)位置的雙光子熒光信號. 2個沿正交方向振動的靈敏電流計振鏡(GM1和GM2)可以實現(xiàn)飛秒脈沖光束在樣本面上的二維點掃描，由此得到對應(yīng)的二維雙光子熒光顯微圖像.

圖3 雙光子熒光顯微系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

考慮到雙光子顯微成像系統(tǒng)的成本問題，通常采用無校正環(huán)的物鏡， 此時會出現(xiàn)折射率不匹配的問題，從而導致球差的出現(xiàn)，該種情況最為常見且對成像質(zhì)量的影響最大. 因此，下面以球差為例，通過實驗說明雙光子熒光顯微系統(tǒng)中像差對三維點擴散函數(shù)的影響.

本文采用帶有校正環(huán)的水浸物鏡(Olympus, XLPLN25XWMP2, NA1.05,25×)作為雙光子熒光顯微系統(tǒng)的物鏡，使用直徑為0.2 μm的熒光微球(Thermofisher, G200)對該系統(tǒng)的三維點擴散函數(shù)進行實驗標定，激發(fā)光波長為 920 nm. 在實際光學顯微成像中，當將生物樣品置于一定厚度的蓋玻片下時，由于玻璃、水、生物樣品的折射率不同，聚焦的激發(fā)光將會引入球差，從而造成激發(fā)光三維點擴散函數(shù)的畸變，且隨著成像深度的增加，球差增大，導致成像質(zhì)量顯著下降.

實驗中將熒光微球樣本放置于1.5號蓋玻片下，蓋玻片的折射率為1.51，水的折射率為1.33，若不進行像差校正，激發(fā)光經(jīng)過折射率不匹配的2層介質(zhì)聚焦會引入球差. 由于所使用的物鏡校正環(huán)具有球差補償功能，其基本原理是通過機械旋轉(zhuǎn)該校正環(huán)，改變物鏡中特定內(nèi)置透鏡的間距，從而改變不同光瞳半徑的光引入的光程，進而補償原本由于折射率不匹配造成的球差. 圖4(a)為調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使球差得到完全補償時，所測量的系統(tǒng)三維點擴散函數(shù)，其橫向、軸向分辨率分別為0.56 μm,2.9 μm. 圖4(b)為調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使引入的球差補償量最小時，得到系統(tǒng)三維點擴散函數(shù)，其橫向、軸向分辨率分別為0.59 μm,4.11 μm. 圖4(c)為調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使引入的球差補償量最大時，得到系統(tǒng)三維點擴散函數(shù)，其橫向、軸向分辨率分別為0.71 μm,6.29 μm.

圖4 物鏡校正環(huán)補償球差時，雙光子熒光顯微系統(tǒng)的點擴散函數(shù)

同時，對使用上述物鏡時系統(tǒng)的點擴散函數(shù)進行數(shù)值仿真，模擬1.5號蓋玻片(取蓋玻片厚度為0.17mm)引入的球差對系統(tǒng)三維點擴散函數(shù)的x-z截面分布情況的影響.仿真結(jié)果[圖5(b)]與實驗結(jié)果中球差欠補償[圖6(b)]時的軸向強度分布趨勢一致.

從數(shù)值仿真和實驗結(jié)果可以看出，當球差不能得到有效補償時，三維點擴散函數(shù)分布會偏離理想情況，軸向分辨率明顯變差，同時產(chǎn)生軸向次主瓣，使主瓣能量占比下降. 這些情況都會降低雙光子激發(fā)效率，因此在進行雙光子熒光顯微成像實驗前要調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)使之恰好補償系統(tǒng)的固有球差.

(a)點擴散函數(shù)仿真圖

(b)強度分布曲線圖5 平板玻璃引入球差后，點擴散函數(shù)的仿真圖及軸向強度分布曲線

(a)恰補償

(b)欠補償

(c)過補償圖6 三維點擴散函數(shù)軸向強度分布的高斯擬合曲線

4 結(jié)束語

本文分析了各澤尼克多項式所描述的像差，基于矢量衍射理論研究了波前像差對雙光子熒光顯微系統(tǒng)中三維點擴散函數(shù)的影響，并通過熒光微球的雙光子熒光成像實驗驗證了球差造成的三維點擴散函數(shù)畸變. 在生物顯微成像中，可采用自適應(yīng)光學技術(shù)補償光學系統(tǒng)及生物樣品所引入的波前像差[4,10]，降低三維點擴散函數(shù)畸變，以提高雙光子熒光的激發(fā)效率，并進一步提高成像深度. 在實際教學中，通過將課堂講述的理論基礎(chǔ)與課下數(shù)值仿真及實驗驗證相結(jié)合，能夠讓學生深刻理解雙光子熒光顯微系統(tǒng)中波前像差對三維點擴散函數(shù)的影響.