HMGB1對鼻咽癌細胞增殖和轉移影響的相關研究

蔡友錚，孫麗清，盧燕，黃玉鈿，鄭友珍，翁雅彬

福建醫科大學附屬福州市第一醫院耳鼻咽喉科，福建福州 350005

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）的發病率位居頭頸惡性腫瘤之首，早期臨床癥狀不典型，同時具有高轉移、高復發和低分化的特征，因此臨床上極難較早發現[1-4]。HMGB1（high mobility group box-1 protein）異常表達與口腔癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤的發生發展和轉移密切相關[5-7]。但目前對于HMGB1與鼻咽癌的關系還缺乏了解[8-11]。該研究方便選取2019年10月—2020年9月福州市第一醫院耳鼻咽喉科診斷治療的鼻咽炎和鼻咽癌患者臨床標本各25例，探索HMGB1高表達與鼻咽癌發生的相關性，并初步驗證HMGB1對體外培養的鼻咽癌細胞生長、侵襲和遷移的影響，為能否通過檢測HMGB1對鼻咽癌進行診斷、治療以及預后評估提供新的策略。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取在福州市第一醫院耳鼻咽喉科診斷治療的鼻咽炎和鼻咽癌患者共50例，根據病理報告分為兩組，鼻咽炎25例，其中男15例，女10例；年齡最小25歲，最大60歲，平均年齡（45±8）歲。鼻咽癌25例，其中男13例，女12例；年齡最小22歲，最大63歲，平均年齡（42±9）歲。所選患者均符合臨床診斷標準，已簽署知情同意書，且經醫院醫學倫理委員會批準。兩組患者的一般資料經對比，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑 人鼻咽癌細胞株CNE2購自逸漠生物公司。HMGB1shRNA（#1～3）及空載體對照的慢病毒購自載基生物有限公司，HMGB1抗體購自proteintech公司。CCK8增強型溶液、草胺酸結晶紫染色液（0.1%）購自meilune公司。Matrigel膠，Transwell小室及24孔遷移板購自美國corning公司。

1.2.2 免疫組織化學染色 鼻咽癌及鼻咽炎患者樣本石蠟包埋后切片（4～5μm）,使用兔/鼠IgG-兩步法免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（博士德生物公司）染色，具體步驟參照試劑盒說明書。正置顯微鏡下觀察拍照，統計染色呈陽性細胞百分比。

1.2.3 細胞培養 CNE2細胞用DMEM(高糖)基礎培養基加10%胎牛血清及抗生素培養，間隔1～2 d更換培養液，細胞生長至80%左右消化傳代。

1.2.4 慢病毒轉染 狀態良好的細胞接種于6孔板培養7～12 h。對照（含有空載體）和含有HMGB1shRNA病毒在冰上緩慢融化后，根據病毒滴度等量稀釋到1 mL加入6孔板，6 h后重復轉染1次，12 h后換成普通培養基并加入嘌呤霉素篩選，得到穩轉株。穩轉株RT-qPCR驗證干擾效率。

1.2.5 細胞增殖檢測 96孔板按每孔8×104個接種細胞，24 h后每孔加入10μl的CCK-8溶液，培養1.5 h后測其OD450。

1.2.6 細胞劃痕實驗 細胞接種于6孔板中培養,待細胞長至80%～90%左右，用移液器槍頭直線劃痕，PBS輕柔清洗兩遍以去除漂浮細胞，在不同時間點觀察，并分別測量各孔的劃痕寬度。

1.2.7 Transwell細胞遷移實驗 細胞胰酶消化后，在無血清培養基中將細胞濃度調整為2.5×105/mL，Transwell小室每個加入200μl的細胞懸液，小室下的孔中加入含10%血清的培養基，培養1 d，倒出培養基，用4%多聚甲醛固定已遷移到濾膜外側的細胞并用結晶紫染色，再擦去濾膜內側的細胞，顯微鏡下觀察并計數，每孔計數5個視野，取平均值。

1.2.8 Transwell細胞侵襲實驗 按1:9的比例稀釋Matrigel膠，鋪于Transwell底部濾膜上，用來模擬細胞外基質，重復1.2.6實驗步驟。

1.2.9 RT-qPCR使用RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa）提取細胞總RNA，并用NovoScriptPlus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（Novoprotein）反轉錄成cDNA，具體步驟參照試劑盒說明書。分別用HMGB1和GAPDH引物對反轉錄得到的cDNA進行qPCR擴增，以GAPDH為內參計算細胞中HMGB1 mRNA水平。

1.3 觀察指標

比較鼻咽炎與鼻咽癌患者組織的HMGB1陽性細胞百分比。比較HMGB1shRNA病毒轉染的穩轉細胞株中HMGB1的mRNA表達水平，CCK-8活性，及其在細胞劃痕實驗中的劃痕寬度變化，以及在Transwell實驗中同等面積下發生遷移或侵襲的細胞個數。

1.4 統計方法

采用GraphPad Prism 5.0統計學軟件處理數據，計量資料以（(±s）表示，組間差異比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMGB1在鼻咽癌中高表達

免疫組織化學染色檢測鼻咽癌及鼻咽炎患者樣本各25例。結果顯示，鼻咽癌患者組織的HMGB1陽性細胞百分比為（17.79±12.71）%，顯著高于鼻咽炎患者組織的HMGB1陽性細胞百分比（7.80±5.57）%，差異有統計學意義（t=3.597,P＜0.05）,表明HMGB1在鼻咽癌中高表達。見圖1。

圖1 HMGB1在鼻咽癌組織中高表達

2.2 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細胞株CNE2的增殖

對 照 和 含 有HMGB1shRNA#1、HMGB1shRNA#2、HMGB1shRNA#3的病毒轉染鼻咽癌細胞株CNE2細胞后經嘌呤霉素篩選，得到穩轉細胞株。RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，HMGB1shRNA#1、HMGB1shRNA#2、HMGB1shRNA#3病毒轉染的穩轉細胞株中HMGB1的表達水平均有下調（P＜0.05），其中HMGB1shRNA#1病毒轉染的穩轉細胞株中HMGB1的表達水平下降最明顯，見圖2A。故此后的細胞實驗均選擇使用HMGB1sh RNA#1病毒轉染的穩轉細胞株（以下簡稱HMGB1sh RNA#1細胞）。CCK-8實驗檢測細胞增殖結果顯示，與對照細胞相比，HMGB1shRNA#1細胞的增殖能力顯著減弱（P＜0.05），見圖2B。表明HMGB1能夠促進鼻咽癌細胞株CNE2的增殖。

圖2 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細胞株CNE2的增殖

2.3 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細胞株CNE2的遷移

劃痕實驗結果顯示，對照細胞和HMGB1shRNA#1細胞在0 h時的劃痕寬度差異無統計學意義（P＞0.05），而24 h時HMGB1shRNA#1細胞的劃痕寬度顯著大于對 照 組， 差 異 有 統 計 學 意 義 （P＜0.05）， 說 明HMGB1shRNA#1細胞遷移能力顯著下降。而Transwell細胞遷移實驗也顯示，與對照細胞相比，發生遷移的HMGB1shRNA#1細胞顯著減少（P＜0.05），進一步驗證了HMGB1shRNA#1細胞遷移能力下降。這些都表明HMGB1能夠促進鼻咽癌細胞株CNE2的遷移。見圖3、圖4。

圖3 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細胞株CNE2在劃痕實驗中的遷移能力

圖4 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細胞株CNE2在Transwell實驗中的遷移能力

2.4 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細胞株CNE2的侵襲

Transwell細胞侵襲實驗結果顯示，與對照細胞相比，HMGB1shRNA#1細胞發生侵襲的顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.01），說明HMGB1shRNA#1細胞侵襲能力下降。表明HMGB1能夠促進鼻咽癌細胞株CNE2的侵襲。見圖5。

圖5 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細胞株CNE2的侵襲能力

3 討論

HMGB1隸屬于高遷移率族蛋白，主要表達于細胞核內，是一種不屬于組蛋白的染色體結合蛋白，與體內如細胞的增殖、分化和遷移等多種生命活動有關[5,10-11]。研究發現，HMGB1與其受體的異常表達與口腔癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤的發生發展和轉移密切相關，在腫瘤發生發展過程中有著重要作用[5-11]。近期的研究顯示，在大腸癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤里，HMGB1還能被腫瘤細胞分泌到細胞外，通過自分泌與旁分泌促進自身和其他腫瘤細胞的增殖與轉移，提高腫瘤細胞的放療耐受性[12-15]。相較于其他腫瘤，目前對于HMGB1在鼻咽癌發生發展過程中作用機制的研究還十分有限。

該研究的結果表明，HMGB1在鼻咽癌發生發展過程中也有著重要作用。鼻咽癌患者組織的HMGB1陽性細胞百分比 （17.79±12.71）%顯著高于鼻咽炎患者（7.80±5.57）%（t=3.597,P＜0.05）；而此前的報道顯示，HMGB1在口腔鱗癌組織中的高表達率（67.46%）高于口腔黏膜正常組織（0.00%）（χ2=13.242，P＜0.001）[16]，在直腸癌組織中高表達率（52.2%）顯著高于在癌旁組織（21.7%）(χ2=9.144，P=0.002)[17]；表明鼻咽癌和口腔鱗癌及直腸癌都存在HMGB1高表達。而對體外培養的人鼻咽癌細胞株CNE2的增殖和轉移實驗顯示，敲低HMGB1的表達水平后，細胞增殖明顯減慢（P＜0.05），細胞遷移能力下降（P＜0.05），細胞侵襲能力下降 （P＜0.01）；而此前的研究顯示，人鼻咽癌細胞株C666-1中干擾HMGB1的表達后，細胞增殖明顯減慢（P＜0.001），遷移能力明顯下降（P＜0.001）,侵襲能力明顯減弱（P＜0.001）[18-19]；雖然由于兩株人鼻咽癌細胞株本身遺傳背景不同，HMGB1表達水平不同，實驗中HMGB1敲低或干擾的效率也有很大差別，導致兩組實驗根本不存在任何可比性，但兩者都得到了相同的結論，說明HMGB1能促進細胞增殖，增強遷移能力和侵襲能力。這些結果都表明HMGB1可能對鼻咽癌發生發展有重要的促進作用，但對于HMGB1促進鼻咽癌細胞的增殖和轉移的具體信號通路還有待今后的進一步研究。

鼻咽癌是一種源自于鼻咽部上皮細胞且具有特殊人種和地域分布的實質性惡性腫瘤，其發病率位居頭頸惡性腫瘤之首[1-4]。由于鼻咽癌的解剖位置隱匿、早期臨床癥狀不典型，同時具有高轉移、高復發和低分化的特征，因此臨床上極難較早發現，早期診斷率不到20%。而鼻咽癌目前臨床上治療主要以放療及輔助化療為主[1-4,20-21]。盡管近年來隨著治療手段的不斷進步，患者的生存率得到顯著提高，但鼻咽癌早期即易發生頸部淋巴結轉移并有遠處轉移的可能，而一旦發生轉移則預后很差[22-23]。因此，尋找新的鼻咽癌特異性標志物和預后評估因子，對治療鼻咽癌有著重要作用。該研究發現HMGB1不僅在鼻咽癌樣本中高表達且能直接促進鼻咽癌細胞的增殖和轉移，不僅有助于更好地了解鼻咽癌發生發展的分子機制，更可以為鼻咽癌的早期診斷和治療提供新的方向和目標。