北方寒區阿特拉津降解菌分離鑒定

楊皓昀 高梓峰 雷杰云 陳忠誠 欒貴東 羅安恒 劉明

摘 要：利用富集培養法，從北方寒區施用阿特拉津的玉米地土壤中，分離出1株阿特拉津高效降解菌GH1，結合其形態、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，將菌株GH1初步鑒定為產脲節桿菌（Paenarthrobacter ureafaciens）。菌株GH1在36h內能完全降解100mg/L的阿特拉津，這為北方寒區特定環境中阿特拉津的修復提供了良好的菌株資源。

關鍵詞：阿特拉津;生物降解;16S rRNA;產脲節桿菌

中圖分類號 X592? 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）19-0018-03

Isolation and Identification of Atrazine Degrading Bacteria from Northern Cold Region

YANG Haoyun et al.

（College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

Abstract： An atrazine degrading strain GH1 was isolated from the soil of maize field applied with atrazine by enrichment culture method in the cold region of northern China. Combined with its morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis， the strain GH1 was identified as Paenarthrobacter ureafaciens. The strain GH1 can completely degrade 100mg/L atrazine within 36h， which provides a good strain resource for atrazine remediation in the unique environment of northern cold region.

Key words： Atrazine; Biodegradation; 16S rRNA; Paenarthrobacter ureafaciens

雜草嚴重制約著農業生產。隨著農藥的發展，除草劑逐漸成為雜草防除的重要措施。黑龍江是我國農業大省，人均耕地面積0.31hm2，是全國的3倍。在地多人少的特定條件下，除草劑的用量非常大，占農藥用量的85%以上，居全國第1位。阿特拉津（Atrazine）又名莠去津，是一種三氮苯類除草劑，廣泛用于玉米、高粱田等的一年生闊葉雜草的防除。由于其雜草防除效果較好，價格相對便宜，投入產出比較高，在東北寒區的禾本科作物田除草劑中占據非常重要的地位。但隨著阿特拉津的連年、超量使用，對人類的生存健康、后茬作物的安全、黑土資源及生態環境構成了嚴重威脅，并且在部分地區已經影響到大豆玉米輪作制度的正常開展[1]。

目前，關于阿特拉津的降解，科研人員開展了大量研究，包括物理、化學及生物方法等，其中生物修復由于其對環境友好、無二次污染等優點，具有很強的優越性。目前，已有大量的阿特拉津降解菌被分離出來，如假單胞菌、土壤桿菌、腸桿菌、諾卡氏菌、根瘤菌、紅球菌、節桿菌等[2-6]，但適合北方寒區的降解菌株資源還十分有限。本研究從從北方寒區長期施用阿特拉津的玉米田中采集土壤樣品，進行降解菌分離鑒定以及降解率的測定，以期獲得適應當地特殊環境的降解菌株，為阿特拉津污染環境的修復提供備選資源菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養基 無機鹽基礎培養基：KH2PO4 0.9g、Na2HPO4·12H2O 6.5g、葡萄糖3g、MgSO4 0.2g、NaCl 0.4g，蒸餾水定容至1L，調節pH至7.0，115℃條件下滅菌20min。LB培養基：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g，蒸餾水定容至1L，121℃條件下滅菌20min。

1.1.2 土壤樣品 土樣采集自大興安嶺某農場長期施用阿特拉津的玉米田中。

1.1.3 儀器 高壓蒸汽滅菌器、潔凈工作臺、立式智能精密搖床、生化培養箱、高速冷凍離心機、高效液相色譜儀、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解菌的富集與分離 在潔凈工作臺中將10g土樣加入到含有50mg/L阿特拉津的100mL無機鹽基礎培養基中，30℃、150r/min富集培養7d，然后取10mL富集培養液接種到100mL新鮮的無機鹽基礎培養基中，在其他條件不變的情況下，逐漸增加無機鹽培養基中阿特拉津濃度，分別為100、150、200、250、300、350、400、450、500mg/L，30℃、150r/min富集培養7d。富集結束后，將富集培養液分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍，從中各取0.1mL富集培養液分別涂布于含有100mg/L的阿特拉津的LB固體平板上，置于30℃恒溫培養箱中培養。培養結束后，挑取LB固體平板上產生明顯水解圈的單菌落，并在LB平板上連續劃線純化培養，直到獲得純化菌株。

1.2.2 阿特拉津的提取及降解率測定 接種OD600=0.5的降解菌懸液1mL于含100mg/L阿特拉津的100mL無機鹽基礎培養基中，30℃、150r/min振蕩培養。培養結束后，取5mL培養液與三氯甲烷（色譜純）按照1∶2的比例混合，分離下層有機相，使用旋轉蒸發儀將有機相濃縮并蒸發至干。最后用甲醇（色譜純）溶液調節定容至1mL，用0.22μm的有機相尼龍膜進行過濾至進樣瓶，采用高效液相色譜儀檢測阿特拉津濃度并計算降解率。高效液相色譜儀參數設置為：采用反相C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相甲醇水溶液，體積比為70∶30，流速為0.8mL/min，可變波長紫外檢測器檢測波長為225nm，柱溫為40℃，進樣量為10μL。