高效液相色譜法測定莪術油乳膏含量*

李文靜，劉軍，李宏鈴，包亞男，朱紅，洪博

(1.齊齊哈爾醫學院藥學院，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省齊齊哈爾市結核病防治院，齊齊哈爾 161006)

莪術油乳膏為齊齊哈爾醫學院藥學院自制制劑，以莪術油為主要原料藥，用于乳腺疾病的防治。李偉澤等[1]報道以莪術二酮和吉馬酮為主要活性成分的乳腺康凝膠膏劑治療乳腺增生療效顯著，且未見不良反應。莪術醇通過下調Bcl-2蛋白表達從而介導抗乳腺癌作用[2]；β-欖香烯經過葉酸修飾被制成納米脂質體，體內外表現出優異的乳腺癌細胞靶向治療作用[3]。筆者在本實驗以莪術二酮、莪術醇、吉馬酮和β-欖香烯為研究對象，建立簡便、準確的高效液相色譜法測定莪術油乳膏中4種主要活性成分含量，以期為建立莪術油乳膏質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 魯能瑞虹高效液相色譜LC-1000D系統(山東魯能瑞虹化工儀器有限公司，包括四元梯度泵、在線脫氣機、柱溫箱，紫外檢測器等)，安捷倫(Agilent)TC-C18色譜柱(美國安捷倫科技股份有限公司)，JP-500C-8中藥材粉碎機(浙江永康市天祺盛世工貿有限公司)，BS124S電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司，感量：0.01 mg)，KQ3200E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 莪術二酮對照品(批號：111800-201001，含量：98.5%)、莪術醇對照品(批號：100185-200506，含量：98.5%)、吉馬酮對照品(批號：111665-201204，含量：98.5%)、β-欖香烯對照品(批號：100268-200401，含量：99.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院。莪術(批號：20150329)藥材均購自亳州市國峰藥業銷售有限公司，產地為安徽亳州，經齊齊哈爾醫學院中藥研究室郭麗娜教授鑒定為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulis的干燥根莖。無水乙醇、磷酸(分析純，天津科密歐化學試劑有限公司，批號：20160629)，色譜純甲醇、乙腈(ThermoFisher 科技有限公司，甲醇批號：40203-15309，乙腈批號：30281-27405)，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司，批號：20180521)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：安捷倫(Agilent)TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-水(B)溶液梯度洗脫。洗脫程序：0～7 min，80%A；>7～12 min，80%→100% A，每次進樣間隔用80%乙腈平衡。檢測波長：216 nm，柱溫25 ℃，流速：1.0 mL·min-1，進樣量10 μL。

2.2貯備液的制備

2.2.1對照品貯備液的制備 分別精密稱取各對照品莪術二酮(1)16.2 mg、莪術醇(2)10.8 mg、吉馬酮(3)10.4 mg、β-欖香烯(4)26.0 mg于10 mL量瓶，配制成莪術二酮1.62 mg·mL-1、莪術醇1.08 mg·mL-1、吉馬酮1.04 mg·mL-1、β-欖香烯2.60 mg·mL-1的混合對照品貯備液。

2.2.2供試品溶液的制備 取莪術油乳膏樣品(本實驗室自制，取莪術藥材10 g粉碎，置索氏提取裝置，以水提取，最終得提取液50 mL。取莪術油提取物10 mL，加白凡士林18 g、十六醇28 g、PEG-8蜂蠟18 mL和單硬脂酸甘油酯32 g于研缽，水浴加熱至75 ℃熔化，作為油相。另取月桂醇硫酸鈉24 g、甘油70 mL和純化水500 mL，加熱至同樣溫度，作為水相。將水相細流狀攪拌條件下加至油相，逐漸加量并研磨，至溫度降至 60 ℃時加入主藥，繼續研磨直至冷卻即得，批號：20180213)10 g，置50 mL燒杯，精密加入異丙醇10 mL，加入甲醇40 mL稀釋、超聲溶解提取20 min，放冷，用甲醇定容至刻度，孔徑0.22 μm濾膜濾過，取續濾液10 μL進樣。

2.3專屬性實驗 取莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β-欖香烯混合對照品溶液適量，在上述色譜條件下進樣分析，各組分理論塔板數均不低于3500；另準確稱取空白乳膏，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，精密吸取10 μL進樣分析。樣品中各待測組分與相鄰峰分離度均大于1.5，輔料和提取液不干擾測定，該方法專屬性良好，色譜圖見圖1。

2.4標準曲線的繪制與線性范圍考察 精密吸取各對照品溶液適量，置量瓶，用甲醇逐級稀釋成莪術二酮為0.051～1.62 mg·mL-1、莪術醇為0.034～1.08 mg·mL-1、吉馬酮為0.033～1.04 mg·mL-1、β-欖香烯為0.081～2.60 mg·mL-1的系列標準溶液，將制得的4種待測物6個不同濃度混合對照品溶液，按色譜條件項下進樣10 μL，連續進樣3次取平均值，計算各對照品峰濃度，以濃度為橫坐標(X)、峰面積值為縱坐標(Y)，進行線性回歸，結果見表1，各組分在其相應濃度范圍內線性關系良好(r>0.998 9)。

表1 莪術油乳膏中4種成分標準曲線與線性范圍

2.5精密度實驗 取同一混合對照品溶液(莪術二酮0.101 mg·mL-1，莪術醇0.068 mg·mL-1，吉馬酮0.065 mg·mL-1，β-欖香烯0.162 mg·mL-1)，在上述色譜條件項下測定，連續進樣6次，記錄4個對照品峰面積，并計算6次峰面積RSD。結果RSD分別為2.15%，1.99%，2.25%，1.87%，結果表明本實驗所用儀器精密度良好。

A.空白乳膏；B.4種待測物標準品；C.莪術油乳膏樣品；1.莪術二酮，2.莪術醇，3.吉馬酮，4.β-欖香烯。

2.6重復性實驗 取同一批莪術油乳膏樣品6份，每份10 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定4種待測物成分峰面積，外標法計算濃度及其RSD。化合物莪術二酮、莪術醇、吉馬酮、β-欖香烯RSD分別為1.07%，1.04%，1.19%，1.49%，結果表明本實驗提取測定方法重復性良好。

2.7穩定性實驗 取同一混合對照品溶液(莪術二酮0.101 mg·mL-1，莪術醇0.068 mg·mL-1，吉馬酮0.065 mg·mL-1，β-欖香烯0.162 mg·mL-1)，室溫放置，按“2.1”項色譜條件進樣分析，分別在0，2，4，8，12 h進樣10 μL，測定莪術二酮、莪術醇、吉瑪酮和β-欖香烯峰面積，RSD分別為0.85%，1.21%，0.91%和1.02%。結果表明4種待測成分的溶液在12 h內穩定性良好。

2.8加樣回收率實驗 取同一批莪術油乳膏(批號：20180213)6份，每份5 g，精密稱定，加入適量4種化合物標準品(相當于樣品含量50%，100%，150%)到供試樣品，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積并通過外標法計算濃度，計算各待測成分加樣回收率及RSD。結果見表2，顯示加入4種待測物成分樣品的平均加樣回收率為93.67%～98.73%，RSD<2.75%，表明本實驗方法準確可靠。

表2 莪術油乳膏中4種成分加樣回收率實驗結果

2.9樣品含量測定 取3批莪術油乳膏樣品，每批3份，每份樣品取10 g，精密稱定，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，外標法計算各批4種待測物含量，結果見表3。

表3 莪術油乳膏樣品含量測定結果

3 討論

莪術油乳膏作為一種透皮制劑，可以避免肝腸循環，還可直接作用于靶部位，直接給藥效果優于口服或其他途徑。目前在國內對含中藥材成分的乳膏劑尚無統一標準，但以乳化為基本操作工藝的產品必須按一定的標準進行檢測。筆者在本實驗采用高效液相色譜法測定莪術油乳膏含量，方法簡單、穩定，重復性好，處方中基質不干擾測定，測定結果準確可靠，可為建立莪術油乳膏的質量標準奠定基礎。實驗中進行色譜條件優化，由于本實驗待測4種酚酸類成分極性相近，為達到良好分離度。筆者在本實驗采用梯度洗脫，結合文獻考察不同流動相和檢測波長對樣品分離效果的影響，有機相采用甲醇-水、乙腈-水加入不同比例磷酸，分別組合挑選最優流動相，經過多次調整洗脫條件，最終確定以乙腈-水溶液系統作為流動相，4個活性成分得到較好地分離，且柱效較高，拖尾現象得到改善。

多年臨床試驗證實，中藥提取液含有揮發油成分的適宜做成乳膏，但乳膏中一些有效成分尚不明確，加上基質影響，乳膏化學成分復雜，給質量控制帶來難題。筆者在本實驗對莪術油乳膏提取條件進行優化，以待測4個組分提取率為考察指標，考查提取方法、提取溶劑、料液比等因素，因為莪術油有一定揮發性，所以不適合加熱提取，最終本實驗確定采用甲醇超聲提取方法，該方法準確、簡單、重現性好。本實驗對莪術油乳膏中主要活性成分進行了含量測定，除此之外，筆者還將對乳膏其他特性進行測試，如外觀性狀、氣味、手感、pH值、黏度、皮膚刺激性、穩定性評價實驗等。乳膏成分較復雜，運用現代科學手段分析有效成分在機體內的吸收、分布以及代謝，闡釋作用機制，是以后研究的主要方向。