絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2表達增加促進心肌衰老的作用

隗 歆 劉 丹 武 燁,2 呂坤譯 申 言 劉慧榮,2*

(1. 首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069； 2. 代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室，北京 100069； 3. 首都醫科大學燕京醫學院，北京 101300)

數據[1]顯示，中國老年人口已超過1.5億，老年人口即60歲以上人口比例超過10%即進入老齡化社會，因此研究衰老的機制尤為重要。衰老是多種疾病的嚴重危險因素，如心血管疾病、神經退行性疾病、癌癥、慢性阻塞性肺疾病、代謝性疾病等[2]。衰老也可被獨立定義為一種疾病[3]，表現為衰老細胞永久性生長停滯、細胞形態結構及蛋白質表達譜的改變[4]，但細胞衰老的生物學機制尚不十分清楚。

目前已知誘發衰老的機制包括線粒體損傷[5]、DNA損傷[6]、端粒功能障礙[7]等。越來越多的證據[8]表明，線粒體功能障礙是衰老的潛在調節機制。已知線粒體參與能量合成代謝、活性氧的產生、鈣鐵的細胞內穩態及細胞凋亡等多種細胞代謝[9-11]，對于細胞存活至關重要。損傷線粒體在細胞內積聚，線粒體功能障礙使活性氧生成增加，從而加重氧化應激損傷是細胞衰老的重要機制之一[12]。損傷線粒體主要通過線粒體內蛋白酶修復線粒體蛋白的功能及線粒體自噬降解損傷線粒體，共同維持線粒體質量調控。線粒體質量控制是保證線粒體功能的基礎，研究[13]顯示，一種線粒體質量調控蛋白絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2定位于線粒體膜間隙，作為伴侶蛋白降解錯誤折疊的線粒體，修復線粒體功能。在神經組織中，Omi/HtrA2通過保障線粒體質量發揮神經保護作用，Omi/HtrA2的缺乏致線粒體功能障礙是神經退行性疾病的重要發病機制[14]。相反，在心肌組織中Omi/HtrA2表達的增加介導老年心肌損傷，加劇心肌細胞凋亡及缺血再灌注損傷的易感性[15]，提示Omi/HtrA2對細胞的存活具有雙重作用[16-17]。

文獻[18]報道，Omi/HtrA2的活性喪失會引起線粒體功能障礙，促進小鼠早衰。同時，Omi/HtrA2表達過度增加也會引起線粒體功能障礙[19]，但Omi/HtrA2對衰老是否也具有雙重作用，表達增加的Omi/HtrA2是否影響細胞衰老仍不十分清楚。

本文探討了在心肌中表達增加的Omi/HtrA2是否也參與細胞衰老的發生，為Omi/HtrA2對細胞衰老的影響提供病理生理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

心肌特異性過表達Omi/HtrA2轉基因小鼠(4月齡，雄性)由賽業廣州生物科技有限公司提供[實驗動物許可證號：SCXK(粵)2008-0090]。 轉基因小鼠分為野生型WT組與心肌特異性過表達Omi/HtrA2的Omi組，每組6只。實驗動物的使用遵循中華人民共和國衛生部令(現國家衛生健康委員會)(第55號)—醫學實驗動物管理實施細則以及首都醫科大學實驗動物管理細則。所有實驗動物通過首都醫科大學動物保護倫理委員會批準(倫理編號： AEEI-2018-028)。

1.2 主要試劑與材料

H9c2細胞系(北京協和細胞庫)、Omi/HtrA2穩轉H9c2細胞系(賽業生物科技有限公司)、胎牛血清(Peak Serum公司，美國)、青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)、DMEM高糖培養基(Nalgene公司，美國)、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)、PBS(Hyclone公司，美國)、BCA蛋白分析試劑盒及細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。UCF101(Merck公司，美國)，p53抗體(ab26)、p21抗體(ab109199，ab188224)、p16抗體(ab51243，Abcam公司，英國)，GAPDH抗體(E12-052)、β-tublin抗體(E12-043，南京恩晶生物科技有限公司)，山羊抗兔IgG/生物素標記(ZB2301)、山羊抗小鼠IgG/生物素標記(ZB2305，北京中杉金橋公司) 。

1.3 主要儀器

多功能化學發光成像分析系統(BG-gdsAUTO710Pro，北京百晶生物技術有限公司)，光學顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.4 細胞培養及藥物刺激

含10%(體積分數)FBS DMEM高糖培養基培養細胞于CO2培養箱內至60%細胞密度，加入Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101刺激Omi/HtrA2穩轉H9c2細胞48 h，檢測后續指標。

1.5 Western blotting法檢測衰老標志物表達水平

Western blotting心肌組織樣品制備：取凍存心肌組織10 mg，加入100 μL RIPA裂解液，1 μL PMSF蛋白酶抑制劑，1 μL蛋白磷酸酶抑制劑。勻漿破碎心肌組織后，超聲波細胞破碎儀破碎勻漿液20次，12 000 r/min 10 min離心吸取上清棄沉淀。BCA法測蛋白濃度，1∶20比例稀釋心肌組織上清液(1 μL上清+19 μL蒸餾水)，50倍體積BCA試劑A∶1倍體積BCA試劑B制備BCA工作液，每孔加入100 μL BCA工作液，37 ℃水浴30 min，酶標儀讀取562 nm吸光度，按照BCA標準曲線計算各上清濃度，加入蒸餾水稀釋各樣品至最低濃度，加入1/4體積5×lodding buffer上樣緩沖液，99 ℃金屬浴10 min，-20 ℃保存樣品。

Western blotting細胞樣品制備：待細胞長到80%～90%密度，PBS洗3次，六孔板每小皿細胞加入80 μL RIPA裂解液，0.8 μL PMSF蛋白酶抑制劑，0.8 μL蛋白磷酸酶抑制劑。刮取細胞于Ep管內，超聲波細胞破碎儀破碎細胞懸濁液20次，12 000 r/min 10 min離心吸取上清棄沉淀。BCA法測蛋白濃度，加入1/4體積5×lodding buffer上樣緩沖液，99 ℃金屬浴10 min，-20 ℃保存樣品。

制備12%(質量分數)分離膠，上樣量為30 μg蛋白，采用80 V恒壓電泳至樣品自濃縮膠進入分離膠，改為120 V待樣品跑至最底層。400 mA 恒流濕轉1 h，蛋白轉移至PVDF膜后，5%(質量分數)封閉牛奶室溫孵育1 h，TBST洗3次，10 min/次，在對應條帶位置分別加入p53、p21、p16、GAPDH和β-tublin，4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，按1∶1比例配制發光液，置于多功能化學成像發光儀檢測條帶并用Image J分析條帶灰度值。

1.6 β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老

PBS洗細胞3次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫孵育15 min，根據說明書配制β-半乳糖苷酶染色工作液，37 ℃水浴孵育過夜，光學顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 Omi/HtrA2過表達心肌組織衰老標志物表達增加

與野生型相比，Omi組(心肌特異性過表達Omi/HtrA2小鼠)心肌內Omi/HtrA2表達顯著增加(1.007±0.379vs0.456±0.216,P<0.01)(圖1A)。

圖1 Omi/HtrA2過表達心肌組織衰老標志物表達增加Fig.1 The senescence markers increased in the myocardium of overexpressed cardiac-specific Omi/HtrA2 transgenic miceA： Western blotting shows that the expression of Omi/HtrA2 increased in Omi group compared with WT group; B-D： Western blotting results show the expression of senescence markers p53, p21 and p16 increased in Omi group compared with WT group. **P<0.01 vs WT group; n=6 per group. WT: wild type group; Omi: overexpressed cardiac-specific Omi/HtrA2 transgenic mice group.

與野生型相比，Omi組心肌p53表達顯著增加(2.227±0.343vs1.691±0.308,P<0.01)，p21表達增加(0.413±0.136vs0.237±0.190,P<0.01)，p16表達增加(0.336±0.079vs0.220±0.128,P<0.01)(圖1B、C、D)。

2.2 衰老標志物p53、p21、p16與心肌表達增加的Omi/HtrA2呈正相關

衰老標志物p53的表達與心肌組織內Omi/HtrA2的表達呈正相關(r=0.530 8，P<0.05)，p21的表達與Omi/HtrA2表達呈正相關(r=0.590 5，P<0.05)，p16的表達與Omi/HtrA2表達呈正相關(r=0.643 1，P<0.05)(圖2)。

圖2 Omi/HtrA2與衰老標志物表達呈正相關Fig.2 Positive correlation between senescence markers and Omi/HtrA2A-C： The positive correlation between senescence markers p53，p21，p16 and Omi/HtrA2. n=13-14 per group; Omi: overexpressed cardiac-specific Omi/HtrA2 transgenic mice group.

2.3 Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101改善Omi/HtrA2引起的細胞衰老

與對照組H9c2細胞系相比，穩轉Omi/HtrA2細胞p53表達增加(0.936±0.108vs0.586±0.036,P<0.05)，p21表達增加(0.292±0.008vs0.155±0.019,P<0.01)，p16表達顯著增加(0.436±0.069vs0.138±0.083,P<0.01)。

Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101處理Omi/HtrA2穩轉H9c2細胞48 h后，結果顯示：與Omi組細胞相比，Omi+UCF101組衰老標志物p53表達降低(0.682±0.031vs0.936±0.108,P<0.01)，p21表達降低(0.215±0.022vs0.292±0.008,P<0.05)，p16表達降低(0.220±0.055vs0.436±0.069,P<0.05)(圖3)。

圖3 Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101改善Omi/HtrA2穩轉細胞衰老Fig.3 The cellular senescence was ameliorated in Omi/HtrA2 overexpressed H9c2 cells treated by Omi/HtrA2 inhibitor UCF101A-C: Western blotting shows the expression of senescence markers p53, p21 and p16 decreased in Omi/HtrA2+UCF101 group compared with Omi group. D: The β-Galactosidase staining results show the senescent cells decreased in Omi+UCF101group compared with that in Omi group. Scale bar: 100 μm. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs Omi group; Control group: H9c2 cells; Omi group: Omi/HtrA2 overexpressed H9c2 cells; Omi+UCF101 group: Omi/HtrA2 overexpressed H9c2 cells treated by UCF101. n=4 per group.

3 討論

我國已進入老齡化社會，而且老齡化程度正在逐年加劇。在我國老年群體中存在多種年齡相關疾病，如心血管疾病、神經退行性疾病、代謝性疾病等，其發病率隨年齡增長顯著增加[2]。細胞衰老是機體整體衰老的結構基礎，因此研究細胞衰老的機制十分重要。

文獻[20]報道，對衰老細胞的清除可從器官及整體水平逆轉衰老。但心肌組織屬于永久性細胞，不可再生，因此無法通過清除衰老細胞，逆轉心肌衰老。已知心血管疾病的致死率在我國居首位[21]，且衰老是心血管疾病的獨立危險因素[22]，因此，研究心肌衰老的機制十分重要。

目前已知多種因素參與衰老的誘發，越來越多的證據[8]表明，在多種細胞衰老的機制中，線粒體功能障礙是衰老的重要調節機制。線粒體作為真核細胞的“能力工廠”，通過氧化磷酸化分解葡萄糖和脂肪酸產生能量(ATP)。同時，線粒體還參與降解細胞內錯誤折疊蛋白[23]、鈣鐵的細胞內穩態及凋亡信號轉導等，對細胞代謝及存活至關重要[9]。線粒體質量調控包括線粒體生物發生[24]，線粒體內蛋白酶修復損傷線粒體[25]及線粒體自噬降解損傷線粒體[26]等。線粒體質量調控異常導致損傷線粒體的過度積累，加重氧化應激損傷從而誘發細胞衰老的發生[27]。因此，線粒體質量異常是細胞衰老的重要誘因[28-29]。

本實驗室前期研究[30]了一種線粒體質量調控蛋白Omi/HtrA2，Omi/HtrA2由核基因編碼，定位于線粒體膜間隙發揮伴侶蛋白的作用，調控線粒體質量。在線粒體破裂或線粒體外膜通透性增加時，釋放入胞質，與抗凋亡蛋白XIAP結合，激活Caspase3，促進凋亡的發生[31]。文獻[32]報道，Omi/HtrA2的缺乏嚴重影響線粒體質量，且Omi/HtrA2活性喪失誘發小鼠早衰。同時，Omi/HtrA2的表達增加也可影響線粒體功能，參與線粒體損傷[19]。這提示Omi/HtrA2對線粒體質量的調控具有雙重作用，但Omi/HtrA2對細胞衰老是否也具有雙重作用？Omi/HtrA2表達增加是否影響細胞衰老，Omi/HtrA2表達增加是否可作為衰老的標志仍不十分清楚。

本文探討Omi/HtrA2表達增加是否促進細胞衰老。通過Western blotting法檢測衰老標志物表達水平及β-半乳糖苷酶陽性細胞率反映衰老指標的改變。已知細胞周期不可逆停滯是細胞衰老的重要標志。衰老標志物有p53、p21和p16。p53/p21信號通路通過調控細胞周期激活細胞衰老的發生[33]。已知p53在多種損傷刺激下活化，激活下游衰老標志物p21和有絲分裂關鍵蛋白E2F7，共同參與G1細胞周期的阻滯。p16隨年齡呈指數型增加，是最強的衰老標志物之一。獨立于p53/p21通路，通過阻止DNA復制的啟動，參與細胞周期G1/S檢查點的阻斷。β-半乳糖苷酶是細胞衰老的重要標志物，在細胞周期被抑制后，β-半乳糖苷酶活性增加，是目前檢測細胞衰老的金標準[34]。

在本研究中，為驗證心肌中過表達Omi/HtrA2是否促進細胞衰老，筆者構建心肌特異性過表達Omi/HtrA2小鼠，Omi/HtrA2表達顯著增加。同時發現，心肌組織中特異性過表達Omi/HtrA2，衰老標志物表達顯著增加，且表達增加的Omi/HtrA2與衰老標志物p53、p21、p16呈正相關。本課題組在細胞水平構建Omi/HtrA2穩轉H9c2細胞系，過表達Omi/HtrA2后，衰老標志物及β-gal染色陽性率增加，通過UCF101抑制Omi/HtrA2功能，可改善衰老指標。本文證實Omi/HtrA2表達增加促進心肌衰老。已知，Omi/HtrA2活性喪失也可加速小鼠早衰，這提示Omi/HtrA2對衰老的影響具有雙重作用，即Omi/HtrA2活性喪失引起早衰，但Omi/HtrA2過度表達也會引起細胞衰老。因此Omi表達失衡均會引起細胞衰老，保持Omi/HtrA2的水平平衡是保障Omi/HtrA2發揮細胞保護作用的關鍵機制。

那么Omi/HtrA2表達增加可能通過何種機制介導衰老的發生？文獻[18]報道，Omi/HtrA2缺乏引起線粒體功能障礙，加劇細胞衰老。那么Omi/HtrA2作為伴侶蛋白降解錯誤折疊的線粒體蛋白。Omi/HtrA2表達過度增加可能在線粒體內對線粒體膜間隙蛋白降解過度，影響線粒體功能；此外，已知線粒體動力學即線粒體分裂融合的平衡是把控線粒體質量的關鍵因素之一[35]。Omi/HtrA2還可與線粒體內膜蛋白OPA1相互作用[36]，調控線粒體融合，這提示Omi/HtrA2表達過度增加可能通過影響線粒體動力學，引起線粒體分裂融合失衡，進而影響線粒體質量，參與衰老的發生。

本課題組前期研究[37]顯示，心肌中Omi/HtrA2的表達隨年齡增加，且老年時增加的p53通過激活Omi/HtrA2的轉錄促進其在心肌中的表達。本文證實Omi/HtrA2過度表達還可進一步加重心肌衰老，形成心肌衰老損傷的惡性循環，提示維持Omi/HtrA2水平的穩態對維持心肌功能，減緩衰老進程具有重要作用。

本文證實Omi/HtrA2過度表達促進心肌衰老，為Omi/HtrA2表達增加對細胞衰老的影響提供了病理生理學依據。