紫花苜蓿幼苗光合熒光特性對鹽分脅迫的響應

王文靜 麻冬梅 趙麗娟 蘇立娜 李嘉文

(寧夏大學西北土地退化與生態系統恢復省部共建國家重點實驗室培育基地/西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021)

鹽堿土是我國西北地區分布最廣的土壤類型之一，面積約占陸地總面積的25%。寧夏銀北地區鹽堿地面積較大，隨著人口增長與耕地面積減少的矛盾日益突出，寧夏回族自治區政府對于銀北地區鹽堿地的開發和利用高度重視[1]。近年來，為了在銀北地區發展鹽土農業，高效利用鹽堿地，紫花苜蓿已成為該地區廣泛種植的牧草作物之一，種植面積接近4×105m2[2]。光合作用是植物生長發育的物質和能量基礎，約90%的植物生物量來自于光合反應過程[3]。然而，光合作用對鹽脅迫非常敏感，鹽脅迫通過卡爾文循環降低NADPH的消耗，抑制葉綠素合成和Rubisco活性，破壞光合電子傳遞[4]。深入理解鹽脅迫對不同農作物光合反應效率影響的潛在機理，對于篩選耐鹽作物品種和提高鹽漬土栽培農作物產量具有重大意義。近年來，關于植物對鹽脅迫的響應方面開展了大量的研究。結果表明，鹽分脅迫會誘導植物體內某些結構和功能發生變化，進而影響植物的光合生理特性，維持光合作用的能力是判斷植物是否耐鹽的重要指標之一[5]。葉綠素熒光參數作為聯系光合作用和環境關系的內在指標，廣泛應用于植物抗逆性研究中[6]。目前，鹽脅迫對不同植物光合生理的研究主要集中在糧食作物[7-11]、蔬菜作物[12]和木本植物[13,14]上，而對西北鹽堿地區草本植物的報道相對較少。因此，探究鹽脅迫下紫花苜蓿光合熒光特性，對于了解紫花苜蓿的耐鹽機制，促進鹽漬土地的有效利用，實現紫花苜蓿高產穩產具有重要的理論意義和實踐價值。本研究以2個不同品種紫花苜蓿幼苗為試驗材料，揭示鹽脅迫與光合作用及相關指標之間的關系，為寧夏銀北地區鹽堿地開發利用，發展優質牧草產業提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本研究以預實驗挑選出的極度敏鹽品種“國產”和極度耐鹽品種“阿迪娜”為試驗對象，試驗材料均來自于寧夏大學種質資源庫。于2019年5—9月在寧夏大學西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室人工氣候室(N38°30′，E106°8′)進行試驗。苜蓿種子用0.1% HgCI2消毒8min，然后用75%酒精消毒30s，再用蒸餾水漂洗5～6遍，將清洗消毒之后的種子均勻鋪在放好濾紙的培養皿中，并將濾紙用蒸餾水噴濕，放入人工培養箱培養至種子發芽(溫度控制在26℃)。待幼苗長至2葉1心時移至裝有3L Hoagland，s營養液的水培箱進行培養，每3d更換1次營養液。在營養液中培養30d后開始處理。NaCl直接加入水培液中，以便根系直接吸收減少誤差。幼苗生長到3～4片真葉時，開始進行NaCl鹽分脅迫，鹽溶液濃度分別為40mmol·L-1、80mmol·L-1、120mmol·L-1和160mmol·L-1，用M1、M2、M3、M4來表示。以澆灌營養液作為對照(M0)，每個處理3個重復。脅迫15d后，選取全展開葉測定單株的光合指標。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 生長及生理指標測定

采用卷尺進行株高的測定，游標卡尺測定其莖粗。每個脅迫處理分別隨機選取長勢一致的5株測定株高、莖粗和葉面積等生長指標。采用北京澳作生態儀器有限公司便攜式葉綠儀FK-YL02測定SPAD含量。植物樣品收獲后，用去離子水將植株沖洗3次，分成根、莖、葉3部分，置于105℃烘箱中殺青30min，轉至85℃烘至恒重，并稱取其干質量，得到各器官生物量，并計算根冠比。

1.2.2 光合指標測定

1.2.2.1 儀器

采用天津瑞暄科技發展有限公司發布的便攜式光合作用儀Li-6400XT。

1.2.2.2 具體方法

每個脅迫處理選取長勢相近的植株5株，重復3次，測定部位為倒2葉。先將葉片在光合有效輻射1500μmol·m-2·s-1、溫度(28±2)℃、空氣相對濕度40%～50%條件下誘導30min以上，待凈光合速率和氣孔導度相對穩定后開始測定各項指標。

1.2.3 葉綠素熒光參數的測定

1.2.3.1 儀器

采用北京澳作生態儀器有限公司的便攜式葉綠素熒光儀OS5p+。

1.2.3.2 具體方法

每個脅迫處理取長勢相近的植株3株，重復3次，測定部位為倒2葉。暗處理30min后開始測定葉片基礎熒光(Fo)、最大熒光(Fm)和PSII最大光化學轉換效率(Fv/Fm)。自然光下活化30min后，測定最小熒光Fo′、最大熒光Fm′、穩態熒光Fs。

1.3 數據分析

利用Excel 2010軟件進行數據處理分析，利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析和多重比較(LSD<0.05)，利用R軟件進行相關性分析和驅動力分析，采用Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗生長的影響

如圖1所示，與M0處理相比，M1脅迫處理對“國產”幼苗的株高、基徑和葉面積增長產生了顯著的抑制作用，其分別降低5.77%、20.13%和13.73%，M1與M2、M3、M4處理間無顯著差異。M2處理對“國產”幼苗葉片的SPAD含量有明顯抑制作用，較M0相比降低23.33%，M2與M3、M4處理間差異不顯著。M1脅迫處理顯著抑制了“國產”幼苗干物質量，根干重、莖干重、葉干重和總干重較M0處理相比分別降低15.97%、33.51%、10.47%和23.04%，以M4處理的幼苗干物質量最低。

隨著脅迫強度的增加，“阿迪娜”幼苗地上部生長指標均表現為下降趨勢，但各生長指標與M0處理間無顯著性差異。鹽脅迫對“阿迪娜”葉片SPAD含量無顯著抑制作用。與M0處理相比，M2處理對“阿迪娜”干物質量的積累有顯著降低趨勢，根干重、莖干重、葉干重和總干重分別降低22.30%、30.61%、24.31%和25.88%，以M3處理的幼苗干物質量最低。M1處理與M0相比顯著降低根干重，其降低16.22，對其它器官干重和總干重的影響不顯著。與對照相比，M4處理對根冠比有顯著促進作用，增加比例達24.24%，而與其它脅迫處理差異不顯著。

2.2 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗光合特性的影響

2.2.1 凈光合速率

不同脅迫處理下，“國產”和“阿迪娜”凈光合速率隨NaCl濃度的增加均呈下降趨勢。以“國產”為例，M1、M2、M3和M4處理均與M0處理呈顯著性差異，而M2與M3和M4處理間差異性不顯著。M1處理較M0處理相比顯著降低17.40%。“阿迪娜”幼苗葉片的凈光合速率在鹽脅迫處理(M1～M4)下,較M0處理分別降低14.62%、24.92%、44.08%和44.85%，其中M1和M2處理間差異不顯著，M3和M4處理間差異不顯著。M2處理下“阿迪娜”的凈光合速率高于“國產”，存在顯著性差異，其它鹽濃度處理下兩者比較均不顯著。且在圖中可以看出，M2處理時“國產”的凈光合速率較M1下降趨勢遠遠大于“阿迪娜”，也就是隨著鹽濃度升高對“國產”的影響大于“阿迪娜”，見圖1a。

圖1 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗葉片氣體光合參數的影響

2.2.2 胞間CO2濃度

不同脅迫處理下，“國產”和“阿迪娜”葉片胞間CO2濃度隨NaCl濃度的增加均呈上升的趨勢，其中“國產”在M2處理時達最低值，“阿迪娜”在M3處理時達最低值。“國產”M1處理的胞間CO2濃度較M0相比差異不顯著；而“阿迪娜”M1處理較M0相比呈顯著性差異，其降低10.92%。M1和M3處理下“國產”胞間CO2濃度高于“阿迪娜”且差異顯著，M2處理時相反，“阿迪娜”胞間CO2濃度高于“國產”，見圖1b。

2.2.3 氣孔導度

不同脅迫處理下，“國產”和“阿迪娜”葉片氣孔導度隨NaCl濃度的增加均呈下降趨勢。其中，“國產”M2處理對氣孔導度的抑制作用最強，較對照相比顯著降低87.88%，M2與M3和M4處理間差異性不顯著。M1處理較對照相比顯著降低24.24%。“阿迪娜”M1處理的氣孔導度較對照相比顯著下降34.62%，M1處理與M3和M4處理呈顯著性差異，見圖1c。

2.2.4 蒸騰速率

不同脅迫處理下，“國產”和“阿迪娜”葉片蒸騰速率隨NaCl濃度的增加均呈下降趨勢，與凈光合速率變化趨勢一致。其中，“國產”在M2處理下達最低值，較M0處理相比降低81.47%，M2與M3和M4處理間差異不顯著。M1處理較M0處理相比降低29.97%。而“阿迪娜”M1處理較對照相比下降26.42%，且M3和M4處理間呈顯著性差異。以M2處理為界限，鹽濃度低于80mmol·L-1時，“國產”蒸騰速率高于“阿迪娜”；80～160mmol·L-1時，“阿迪娜”蒸騰速率明顯居高，說明隨著鹽濃度升高敏鹽品種“國產”的蒸騰速率較低，而耐鹽品種“阿迪娜”更容易適應鹽脅迫條件生長，見圖1d。

2.2.5 水分利用效率

不同脅迫處理下，“國產”和“阿迪娜”葉片水分利用效率隨NaCl濃度的增加呈先升后降的趨勢。“國產”和“阿迪娜”均在M2處理達到最大值，其最大水分利用效率分別為5.206μmol·mmol-1和3.407μmol·mmol-1，并且可以看出，在4個不同濃度的鹽脅迫處理下“國產”的水分利用率均高于“阿迪娜”，見圖1e。

2.2.6 氣孔限制值

不同脅迫處理下，“國產”和“阿迪娜”葉片氣孔限制值隨NaCl濃度的增加呈先升后降的趨勢。M2～M4處理的“國產”葉片氣孔限制值顯著高于M0和M1處理。“阿迪娜”鹽脅迫處理的氣孔限制值均顯著高于對照，且M3與M1處理間呈顯著性差異，見圖1f。不同鹽濃度脅迫處理下，“阿迪娜”的氣孔限制值高于“國產”，只有在M2處理下“國產”氣孔限制值反超“阿迪娜”。可以看出，不同鹽脅迫處理對作物光合作用的影響具有一定差異，且會減少進入氣孔的CO2，不能滿足光合作用的要求影響作物生長。

2.3 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗葉綠素熒光特性的影響

如圖2所示，鹽脅迫下，2個品種紫花苜蓿幼苗葉片Fv/Fo和Fv/Fm均呈下降趨勢。與對照相比，“國產”幼苗M1～M4處理的Fv/Fo顯著下降8.08%、9.70%、7.16%和17.55%；而M4處理的Fv/Fm較對照相比顯著下降14.29%。鹽脅迫對“阿迪娜”幼苗葉片的Fv/Fo和Fv/Fm均無顯著影響，見圖2a、圖2b。在M1～M3鹽脅迫處理下，2個品種紫花苜蓿幼苗葉片ETR與對照相比無顯著性差異；在M4鹽脅迫處理下，“國產”幼苗葉片ETR較對照相比顯著下降17.52%。“阿迪娜”幼苗葉片ETR較對照顯著降低8.39%，見圖2d。在M1脅迫處理下，“國產”幼苗葉片ΦPSII、qP、NPQ與對照相比差異性不顯著；在M2～M4處理下，“國產”幼苗葉片qP和ΦPSII隨著鹽濃度的增大顯著下降，而NPQ則隨之顯著上升。與對照相比，M4處理下“阿迪娜”幼苗葉片ΦPSII、qP顯著降低26.87%、25.88%。鹽脅迫對“阿迪娜”幼苗葉片NPQ無顯著抑制作用，見圖2c、圖2e、圖2f。

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圖2 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗葉片熒光參數的影響

2.4 鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生物量與光合參數相關性分析

如圖3所示，“國產”和“阿迪娜”幼苗葉片總干重與SPAD含量、凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率呈顯著正相關關系，根冠比與SPAD含量、凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率呈顯著負相關關系；蒸騰速率和SPAD含量、凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度兩兩之間均呈顯著正相關關系。

圖3 鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生物量與光合參數相關性分析

2.5 鹽脅迫、葉綠素含量、光合參數對紫花苜蓿幼苗生物量變化的貢獻

利用R軟件里面的BioEnv程序包篩選出對“國產”和“阿迪娜”幼苗生物量變化具有顯著影響的光合參數為凈光合速率(Pn)和SPAD含量，再通過方差分解分析(VPA)可得出鹽脅迫與光合參數以及二者共同作用對“國產”和“阿迪娜”幼苗變化的貢獻，如圖4所示。鹽脅迫(Ss)、Pn和SPAD含量以及三者之間交互作用解釋幼苗生物量變異的比例為44.3%。對于單個因子來說，Ss、Pn(P=0.155)；Ss與Pn共解釋幼苗生物量變化的比例為7.24%(P=0.001)，Pn與SPAD含量共解釋幼苗生物量變化的比例為13.2%(P=0.001)，Ss與SPAD含量共解釋幼苗生物量變化的比例為-0.27%(P=0.001)，3個因子共解釋幼苗生物量變化的比例為23.67%(P=0.001)。

圖4 紫花苜蓿幼苗生物量變化的驅動力分析

3 討論

3.1 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗生長和生物量變化的影響

生物量是評估鹽脅迫程度和植物抗性的可靠指標[17]。相關研究表明，鹽脅迫條件下植物生長會產生抑制作用，且鹽脅迫程度越高，受抑制現象越明顯[18]。就鹽生植物而言，當鹽脅迫程度沒有超過生長臨界值時，同化作用不會被抑制，甚至較低的鹽濃度會促進植物生長[19]。本文研究發現，不同濃度鹽脅迫處理下，“國產”幼苗株高、基徑、葉面積及生物量均顯著低于對照，而“阿迪娜”的生長指標與對照相比有下降趨勢，但無顯著性差異，見表1。可見，“國產”苜蓿品種在鹽脅迫條件下表現出較強的敏鹽性。“阿迪娜”幼苗莖葉干重和總干重在M1處理中與對照相比差異性不顯著，而根干重隨著鹽脅迫程度的加劇顯著下降，見表1，說明根干重在鹽脅迫條件下表現出較強的敏鹽性。然而鹽脅迫對“國產”和“阿迪娜”的影響機理不同。就本研究結果而言，“阿迪娜”比“國產”的耐鹽性更強，40mmol·L-1(M1)的鹽濃度可能更適合“阿迪娜”生長發育，而160mmol·L-1(M4)的鹽濃度可能為“國產”和“阿迪娜”的最大耐鹽臨界值。

表1 鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗生長指標變化

根冠比能夠表征光合產物在生物量中的分配方式[20]。本試驗結果表明，“國產”和“阿迪娜”幼苗的根冠比隨著鹽脅迫程度的增加而增加，高鹽脅迫處理的根冠比顯著高于對照，見表1。且“國產”的根冠比值較大于“阿迪娜”，表明鹽脅迫條件下，“國產”幼苗根系擴散能力較快，分配到的同化產物遠高于地上部。可見，“國產”增加生物量在根系的分配有利于獲取更多的水分和營養，從而增強植物的生長能力，也稀釋了細胞內的鹽分[21]。這一結論與郭麗麗等[12]針對番茄的研究結果不一致，其原因可能是紫花苜蓿和番茄2種植物在逆境鹽脅迫條件下改變生物量的分配模式存在一定差異。

3.2 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗光合參數變化的影響

葉綠素含量的變化可直接或間接反映植物葉片光合能力的強弱，是評價植物耐鹽程度的重要生理指標[22]。本文研究表明，“國產”的SPAD含量隨著鹽濃度的增加呈顯著下降趨勢；低濃度脅迫處理能使紫花苜蓿幼苗SPAD含量略增加，且“阿迪娜”的增幅較大，見表1。這一結果與孫璐等[9]針對高粱作物的研究結論一致。而鹽脅迫條件下“阿迪娜”SPAD含量變幅微小，可見其對鹽脅迫敏感性程度不明顯。

鹽脅迫對“國產”和“阿迪娜”幼苗葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)產生顯著抑制作用，見圖1，這與前人研究結果相似[9-12]。并且鹽脅迫下，“阿迪娜”光合參數下降幅度低于“國產”，說明“阿迪娜”具有較強的耐鹽性。鹽脅迫條件下，氣孔限制和非氣孔限制2個因素會對植物的光合作用產生顯著的影響[23]。王慶輝等[24]研究表明，鹽脅迫會破壞根系質膜，引發滲透脅迫，阻礙水分吸收和養分吸收并降低植物進入葉肉細胞的CO2速率，從而導致光合作用減弱，認為光合速率下降是由氣孔因素所限制[25]；而Yang等[26]研究表明，鹽脅迫引發光合速率降低主要是RuBP羧化酶效率降低和光合作用表觀量子效率下降，認為是非氣孔因素所限制。本文研究表明，鹽脅迫下“國產”和“阿迪娜”葉片Pn下降，Gs降低，限制了CO2向葉綠體的運輸。當鹽濃度在40～80mmol·L-1時，胞間CO2濃度(Ci)隨Gs的減小而降低，氣孔限制值(Ls)增加，Pn降低，見圖1。引發這一現象的原因可能是鹽脅迫會破壞根系質膜，引發滲透脅迫，阻礙水分吸收和養分吸收并降低植物進入葉肉細胞的CO2速率，從而導致Ci降低。由此表明，當鹽濃度在80mmol·L-1時，“國產”和“阿迪娜”幼苗葉片Pn下降是由氣孔因素限制，這與前人針對葡萄的研究結果是一致的[27]。“國產”和“阿迪娜”幼苗葉片Gs值隨著鹽脅迫程度的加劇呈緩慢下降的趨勢，但Ci卻呈上升趨勢，Ls逐漸降低，見圖1。產生這一現象的原因可能是高濃度NaCl脅迫可短時間內增強細胞呼吸作用，使鹽離子大量累積，破壞了葉綠體結構，造成葉片光合器官的損傷和葉肉細胞的光合活性下降，說明此時光合速率降低的主要原因是非氣孔限制。綜合以上2點可以看出，隨著鹽脅迫程度的加劇“國產”和“阿迪娜”幼苗光合作用限制均由最初的氣孔制約逐漸轉向非氣孔制約，但抑制光合作用的鹽濃度有所區別，“國產”為M2鹽脅迫水平，而“阿迪娜”則為M3鹽脅迫水平，進一步證實2個品種紫花苜蓿對鹽分敏感程度不同。

水分利用效率(WUE)是植物光合同化效率和水分散失的綜合反映[28]。有研究表明，鹽脅迫條件下葎草幼苗葉片WUE呈上升趨勢[29]，刺槐幼苗葉片WUE呈降低趨勢[30]；另有研究發現，不同白榆品系的葉片WUE呈現先增后減的趨勢[31]。可見，鹽脅迫對植物葉片水分利用效率的影響有許多報道，但結論并不一致。本研究結果表明，鹽脅迫導致“國產”幼苗葉片WUE呈先增后減的趨勢，而“阿迪娜”葉片WUE呈上升趨勢，見圖1e。表明本試驗采用的2個紫花苜蓿品種幼苗的WUE變化趨勢不同，可能與自身遺傳特性有關，如形態結構、同化方式、氣孔調控方式、適應與保護機制、物質同化積累與分配模式等[32]。然而具體原因有待于進一步研究。有研究表明，鹽脅迫條件下保持較高的WUE不僅能滿足自身生長，又能避免逆境帶來的傷害，從而起到主動調節作用，表現出高度適應性[33]。本研究中2個品種幼苗的WUE均在M2處理下達到最大值，表現出較強的適應性。

3.3 鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗熒光參數變化的影響

葉綠素熒光參數對鹽脅迫的響應非常敏感，在反映光合作用過程中光系統對光能的吸收、傳遞、分配、耗散和轉換方面具有獨特的作用[34]。本文研究發現，在高鹽濃度脅迫下，“國產”幼苗葉片Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR和qP均有所下降，而NPQ顯著高于對照，見圖2，說明高鹽脅迫條件下“國產”葉片光系統Ⅱ的激發能分配方式受到了影響，而且越來越多的吸收光能通過非光化學的途徑被耗散來適應鹽脅迫環境。“阿迪娜”幼苗葉片Fv/Fo和Fv/Fm在各濃度鹽脅迫處理間差異不顯著，而其它參數值在高鹽處理下均出現不同程度的降低，見圖2，說明鹽脅迫能使“阿迪娜”有效保持Fv/Fo和Fv/Fm，使光合機構趨于穩定，防止Pn過度下降，這可能是“阿迪娜”幼苗葉片的自我保護機制。

葉綠素作為光合色素中的重要色素分子，不僅能夠攝取外界光源保證植物葉片順利進行光合作用，而且是反映植物葉片光合能力大小的重要光合生理參數[22]。本研究表明，葉片SPAD含量與光合特征參數均呈顯著正相關，見圖3，這與前人在2種菠蘿蜜屬植物上的研究結論一致[11]。光合作用是作物生長發育過程中影響干物質積累的重要環境因子[35]。本文結果表明，紫花苜蓿幼苗總干重與SPAD含量及光合參數呈顯著正相關，見圖3，進一步證實了作物生長過程中增加葉片光合水平和保持較高的SPAD含量有利于促進植株干物質量的積累。鹽脅迫可顯著影響紫花苜蓿幼苗SPAD含量、Pn和生物量。方差分解分析表明，鹽脅迫、SPAD含量和Pn二者及三者之間交互作用解釋幼苗生物量變異的比例均達顯著性。其中三者交互作用影響最大，見圖4。因此，2個品種紫花苜蓿幼苗生物量隨著鹽脅迫水平的提高而降低，與SPAD含量等光合特征參數的降低存在密切關系。

4 結論

鹽脅迫使“國產”和“阿迪娜”葉片的光合參數降低，且“國產”的下降幅度顯著大于“阿迪娜”。產生這種現象的原因主要是“國產”和“阿迪娜”幼苗隨著NaCl脅迫水平的增加，光合作用減弱，由最初的氣孔制約逐漸轉向非氣孔制約。高濃度鹽脅迫對“國產”幼苗葉片Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR和qP產生顯著抑制作用，而NPQ隨著鹽脅迫的增強表現出先升高后降低的趨勢。說明高濃度NaCl脅迫會對“國產”幼苗光系統Ⅱ活性和光能轉換效率產生抑制作用，因此可通過增加光系統Ⅱ非輻射能量的耗散來適應鹽脅迫環境，而“阿迪娜”在耐鹽適應性方面較優于“國產”苜蓿。總體而言，光合熒光特征參數可作為快速判斷紫花苜蓿幼苗耐鹽程度的重要指標。