不同類型殺菌劑對解淀粉歐文氏菌室內毒力測定

陳 偉，段紅雁，李紫英，郝海婷，王 蘭

(塔里木大學植物科學學院/南疆農業有害生物綜合治理兵團重點實驗室/農業部阿拉爾作物有害生物科學觀測實驗站/南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】解淀粉歐文氏菌是引起梨、蘋果、山楂、火棘等薔薇科植物細菌性病害的一種病原細菌，可以侵染40余屬的220種植物[1-2]。防治細菌的主要手段是改良品種和使用農藥。改良品種的周期長，農藥的作用靶標單一，篩選新的殺菌劑類型迫在眉睫[3]。【前人研究進展】王雪等[4](2012)研究結果顯示，抗生素類殺菌劑，無機類殺菌劑對其供試細菌有抑菌效果；梁慧敏等[5](2019)研究結果顯示，內吸性殺菌劑、有機類殺菌劑、植物源類殺菌劑、微生物殺菌劑均對解淀粉歐文氏菌有抑菌效果，但同時參與藥劑篩選的多種抗生素抑菌效果不好。【本研究切入點】研究解淀粉歐文氏菌毒力較強的殺菌劑種類，篩選高效防病藥劑。【擬解決的關鍵問題】以解淀粉歐文氏菌為研究對象，采用最低抑制濃度法在10種殺菌劑中篩選，采用抑菌圈實驗，篩選出對解淀粉歐文氏菌有良好抑菌效果的殺菌劑類型，為解淀粉歐文氏菌引起病害的化學防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

解淀粉歐文氏菌模式菌株 NCPPB1665，由南京農業大學胡白石教授贈。

1.1.2 主要試劑

供試殺菌劑共10種，包括有機雜環類殺菌劑3%噻霉酮微乳劑和12%噻霉酮水分散粒劑、抗生素類殺菌劑6%中生菌素水劑和0.15%四霉素水劑、噻唑類殺菌劑20%噻唑鋅懸浮劑、微生物殺菌劑多黏芽孢桿菌、銅制劑20%噻菌銅懸浮劑、30%噻森銅懸浮劑、33.5%喹啉銅懸浮劑、46%氫氧化銅水分散粒劑。表1

表1 供試殺菌劑Table 1 Bactericide tested

1.2 方 法

1.2.1 培養基、培養條件及菌懸液的制備

營養瓊脂培養基NA：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂17 g，加無菌水至1 L，調pH至7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。供試菌在NA固體培養基上28℃恒溫過夜培養。用無菌接種環刮下培養好的菌苔轉入含無菌水試管中，重懸，根據菌種在600 nm的吸光度值與菌液濃度之間的線性關系(y=0.115ln(x)-1.90[6])用分光光度計調至OD600達0.2，此時菌懸液濃度為108CFU/mL。

1.2.2 殺菌劑最低抑制濃度的篩選

采用含毒介質-最低抑制濃度法[7]獲取利用解淀粉歐文氏菌株NCPPB1665進行藥劑最低抑制濃度的初篩。按照各藥劑的使用說明書對每種藥劑進行濃度梯度稀釋，初試在不同濃度下各藥劑的抑菌效果，取5個不同的藥劑濃度進行最低抑菌濃度測定，每個濃度至少3個重復。將供試的農藥制劑配制成濃度為50 mg/mL的藥劑母溶液，待滅菌的營養瓊脂培養基溫度降至55℃左右時，加入一定體積藥液，混合均勻即制備成一定工作濃度的含藥劑培養基。用移液器將0.5 μL菌懸液接種于培養基上，每個皿上按3個方位點接種3點，對照用相同體積的菌液接種未加藥劑的培養基作對照，重復3次。培養基置于28℃恒溫培養箱中培養48 h，觀察記錄菌落生長情況。

未能辨別出接菌點或有接菌點但干縮的，菌落生長受抑制，以“-”表示;菌點能夠生長并保持濕潤，以“+”表示。記錄每種藥劑在每個濃度下菌落不能生長的最低藥劑濃度標記為C-，根據式C'=(C++C-)/2，計算實驗中的最低抑菌濃度C'，3次實驗結果的均值代表該藥劑最低抑菌濃度。

1.2.3 抑菌圈法

將已熔化NA培養基冷卻至45℃，倒在9 cm培養皿中，每皿15 mL，加入培養好的供試菌懸液100 μL，充分搖勻使其均勻鋪平，冷卻。用6 mm打孔器呈等邊三角形狀打孔，將配制好的藥液用移液槍平穩的打入孔內，每孔10 μL。以無菌水為空白對照，每皿1個處理，倒置在28℃培養箱中培養36 h，重復3次。采用十字交叉法測定抑菌圈直徑(mm)，并以藥劑濃度的對數為自變量，抑菌圈的平均直徑(mm)為因變量，求出毒力回歸方程，并以使抑菌圈直徑達到一定值(試驗以6 mm為基準)時的殺菌劑有效濃度進行毒力比較，按式(1)計算殺菌劑對菌絲生長的抑菌率[8-9]。

抑菌率=[(處理組直徑-對照組直徑)/(處理組直徑)]×100%。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel和DPS7.05軟件對數據進行處理分析。將抑菌率換算成抑制幾率值，藥劑質量濃度轉化為對數值，并用回歸法求毒力回歸方程和相關系數，計算EC50值。

2 結果與分析

2.1 殺菌劑對解淀粉歐文氏菌株 NCPPB1665的最低抑制濃度篩選

研究表明，在參試的10種殺菌劑中有8種對菌株NCPPB1665有抑制作用，有機雜環類中最小抑制濃度3.63(3%噻霉酮)<4.38(12%噻霉酮)，抗生素類中最小抑制濃度6.25(6%中生菌素)小于8.75(0.15%四霉素)，噻唑類最小抑制濃度81.25(20%噻唑鋅)，微生物制劑最小抑制濃度562.5(多粘類芽孢桿菌5億活芽孢每克)，銅制劑中最小抑制濃度175(20%噻菌銅)<325(46%氫氧化銅)。每種殺菌劑種類中最低抑制濃度最小的藥劑，即3%噻霉酮微乳劑(有機雜環類)、6%中生菌素可溶液劑(抗生素類)、20%噻唑鋅懸浮劑(噻唑類)、多黏芽孢桿菌5億活芽孢/g(微生物制劑)、20%噻菌銅懸浮劑(銅制劑)。表2

表2 8劑對供試細菌NCPPB1665最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration of 8 agents against tested bacteria ncppb1665

2.2 不同殺菌劑對解淀粉歐文氏菌株 NCPPB1665 的毒力測定

研究表明，不同種類殺菌劑對解淀粉歐文氏菌株NCPPB1665的毒力作用中，有機雜環類制劑相比其他種類藥劑有效質量濃度是最低，使用同等劑量時該種類制劑具有較強的抑菌作用；抗生素類制劑需要的有效質量濃度低于噻唑類制劑和銅制劑的有效質量濃度，顯示使用同等劑量下，抗生素類制劑具有較強的抑菌作用；微生物制劑在5種類型殺菌劑中抑菌作用稍弱，其有抑菌作用但使用濃度高、抑菌效果較差。

不同種類的參試殺菌劑在供試各濃度下均對模式菌株NCPPB1665具有明顯的抑菌作用。所檢測制劑中對解淀粉歐文氏菌菌株NCPPB1665具有最好抑菌作用的是有機雜環類制劑、抗生素類制劑，毒力最高，EC50值分別為43.148和87.82 mg/L，其余藥劑按毒力大小排序為噻唑類>微生物類>銅制劑類。表3

表3 各藥劑類型室內毒力測定抑菌效果對比Table 3 Comparison of bacteriostatic effect of different types of bactericide

3 討 論

解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)是一種引起毀滅性病害的植物病原細菌，主要危害仁果類果樹和薔薇科植物。該菌自19世紀末首次發現[10-12]。

研究采用了室內離體抑菌活性的方法評價了5大類殺菌劑對解淀粉歐文氏菌的抑制作用，明確了機雜環類、抗生素類、噻唑類、微生物菌劑和銅制劑等5種類型的殺菌劑對解淀粉歐文氏菌的抑菌效果。

有機雜環類殺菌劑又稱異噻唑啉酮類衍生物,對細菌、真菌均有較強的抑制毒殺作用，是一種新型、廣譜殺菌劑。大量研究表明[13-16]，有機雜環類殺菌劑對細菌、真菌病害都有明顯的防治效果，與研究相符，研究中其對解淀粉歐文氏菌的毒力最高，EC50為43.158 mg/L，高于其他種類殺菌劑。

銅制劑作為一種廣譜殺菌劑，對眾多作物的細菌性病害均有突出的防治效果，大量研究表明[17-20]，銅制劑殺菌劑在田間對細菌性病害有較高的防效，研究采用抑菌圈的方法，得到的結果顯示，銅制劑殺菌劑對解淀粉歐文氏菌的抑菌效果較差，而銅制劑的作用機理是，依靠植物表面水的酸化，逐步釋放銅離子，與病菌的蛋白質結合，使其蛋白酶變性而死亡，抑制病菌萌發和菌絲發育，銅制劑的殺菌作用取決于制劑釋放的銅離子濃度，在試驗中較高濃度下表現出抑菌活性，較低濃度下缺少植物表面水的酸化表現較低活性。

4 結 論

有機雜環類殺菌劑對解淀粉歐文氏菌的室內藥效最強，對應藥劑EC50值為43.148 mg/L，其后按EC50值由小到大的排序為抗生素類殺菌劑、噻唑類殺菌劑、微生物殺菌劑和銅制劑殺菌劑，對應藥劑EC50分別為87.82、469.50、4 397.20和4 782.00 mg/L。

5種類型殺菌劑對解淀粉歐文氏菌均有一定的活性，且抑菌效果差別較明顯。其中有機雜環類和抗生素類抑菌效果較好，其次為噻唑類和微生物菌劑抑菌效果，而銅制劑的毒力測定最差。