噻蟲嗪種子包衣棉花對棉蚜和棉長管蚜解毒酶活性的影響

麻正輝，蘇 悅，馬 雪，羊 河，侯國輝，陳柄潤，韓 旭，姚永生

(塔里木大學植物科學學院/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】棉蚜(Aphisgossypii)和棉長管蚜(Acyrthosiphomgossypii)在新疆植棉區(qū)共存發(fā)生[1]，棉蚜取食造成葉片皺縮、植株矮化，又分泌蜜露引發(fā)霉菌危害，影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，棉長管蚜無群集習性，田間種群密度相對較低，對棉花一般不構(gòu)成為害影響。棉長管蚜是棉花苗期發(fā)生的優(yōu)勢種，棉蚜為棉花現(xiàn)蕾期后的優(yōu)勢種，利用棉田早期的棉長管蚜培養(yǎng)天敵，可有效抑制棉花中后期棉蚜的發(fā)生與為害[2-6]。棉蚜在棉花苗期發(fā)生為害，已成為棉花整個生育期的蚜蟲優(yōu)勢種群和新疆棉田的主要防治對象，殺蟲劑施用劑量和頻率越來越高[7]。新煙堿類殺蟲劑噻蟲嗪是棉田常用農(nóng)藥，分析噻蟲嗪包衣對棉蚜和棉長管蚜解毒酶活性的影響，對研究棉田害蟲演替和蚜蟲綜合治理具有重要意義。【前人研究進展】乙酰膽堿酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)、細胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是昆蟲克服毒害物質(zhì)的重要酶系，在昆蟲體內(nèi)能夠參與或幫助代謝分解毒害物質(zhì)，使昆蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性[8-9]。研究表明，AChE在棉蚜對有機磷、氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性中發(fā)揮主導作用[10]，CarE表達量的增加與棉蚜對有機磷抗性的增強有關(guān)[11]。武永強等[12]研究結(jié)果表明，CYP450是棉蚜對噻蟲嗪產(chǎn)生抗性的主要因素，Wei等[13]也認為棉蚜對噻蟲嗪產(chǎn)生抗性是CYP450與酯酶的共同作用。藥劑處理昆蟲后CarE活性顯著上升[14,15]。噻蟲嗪抑制昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體使昆蟲癱瘓死亡，既可以葉面噴霧，也可以用于種子處理，對棉花苗期蚜蟲有較好的防效[16,17]。【本研究切入點】取食噻蟲嗪包衣處理棉花后，棉蚜和棉長管蚜解毒酶活性的變化未見報道。測定棉蚜和棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化。【擬解決的關(guān)鍵問題】使用2、4 g/kg噻蟲嗪包衣棉花，三葉期時采用生化方法測定取食0、2、6、12、24 h后棉蚜和棉長管蚜體內(nèi)解毒酶的活性變化，分析棉蚜和棉長管蚜對藥劑包衣棉花的適應能力，為防控棉田蚜蟲危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試蟲源

棉蚜、棉長管蚜均采自新疆生產(chǎn)建設兵團第一師12團11連試驗田(E 81°33'，N 40°48')，于室內(nèi)人工氣候箱(RTOP-260Y)用棉苗連續(xù)飼養(yǎng)2～3代作為蟲源，棉花品種為新陸中68號，飼養(yǎng)飼養(yǎng)溫度(23±1)℃，相對濕度60%±10%，光周期L∶D=14∶10。

棉種包衣劑量設0(CK)、2和4 g/kg 3種處理，種子包衣后于陰涼通風處自然陰干封存。2020年4月10日于塔里木大學農(nóng)學試驗站覆膜直播，品種為新陸中78號。

1.1.2 供試藥劑及主要儀器

70%噻蟲嗪種子處理可分散粉劑，瑞士先正達作物保護有限公司；羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和細胞色素P450(CYP450)及BCA蛋白定量試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。SCIENTZ-48型高通量組織研磨器(寧波新芝科技股份有限公司)；Fresco 21微量冷凍離心機和Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2 方 法

待棉花長至三葉期，選取長勢健康的棉株清理，挑選大小一致的健康成蚜饑餓2 h后，進行接種試驗，試驗期間用籠網(wǎng)(30×30×50(cm)，200目紗網(wǎng))籠罩。

分別于接種前(記作0 h)及接種后2、6、12、24 h，在受試棉蚜和棉長管蚜中各挑選20頭無翅成蟲，加入1 mL PBS(0.066 mol/L、pH 7.4)冰浴勻漿后離心(4℃，1 200 g，30 min)，取上清得到酶粗提液。離心參數(shù)：AchE、CarE(4℃，1 500 g，30 min)；CYP450、GSTs(4℃，10 000 g，20 min)；測定參照試劑盒，根據(jù)制作的標準曲線和酶原蛋白含量的測定結(jié)果，計算酶比活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25數(shù)據(jù)處理，差異顯著性分析使用Duncan氏多重比較法；繪圖使用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化

2.1.1 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后AChE活性變化

研究表明，2 g/kg劑量處理后AChE活性在2 h時增加9.20%，隨后在6、12、24 h分別降低9.10%、28.23%、33.79%，除24 h外，各時間點較前一時間點活性降低水平均顯著。4 g/kg劑量處理后2、6、12、24 h分別降低34.01%、51.82%、63.48%、64.68%。2 g/kg劑量處理后2 h活性高于CK，其余各時間點均低于CK且高于4 g/kg處理。棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，低劑量2 h(短時)對AChE活性有顯著的誘導作用，但隨時間增加表現(xiàn)為抑制作用，而4 g/kg劑量處理后活性持續(xù)降低。圖1

注：不同小寫字母表示棉蚜解毒酶活性差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicated that the detoxification enzyme activity of Aphis gossypii was significantly different(P <0.05),the same as below圖1 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜AChE活性變化Fig.1 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on AChE of Aphis gossypii

2.1.2 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CarE活性變化

研究表明，棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，2 g/kg劑量處理活性先上升后下降，12 h時顯著高于其它時間點，并高于CK，24 h較12 h降低43.02%。4 g/kg劑量處理后持續(xù)下降，在不同時間點分別下降18.41%、29.26%、42.43%、53.01%，且始終低于CK。圖2

圖2 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜CarE活性變化Fig.2 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CarE of Aphis gossypii

2.1.3 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CYP450活性變化

研究表明，棉蚜CYP450活性的影響隨時間增加最終表現(xiàn)為低劑量的誘導作用和高劑量的顯著抑制作用。4 g/kg處理在0 h時活性最大，2 h時活性顯著下降，隨著時間的繼續(xù)增加略有波動，但不同時間點間無顯著關(guān)系。2 g/kg處理在2 h、6 h較0 h活性分別提高20.35%、31.48%，各時間點間差異顯著，隨后下降，但仍顯著高于0 h。圖3

圖3 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜CYP450活性變化Fig.3 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CYP450 of Aphis gossypii

2.1.4 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后GSTs活性變化

研究表明，棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，低劑量6 h對GSTs有顯著的持續(xù)誘導作用，高劑量則為顯著的持續(xù)抑制作用。2 g/kg劑量處理6 h內(nèi)活性顯著持續(xù)上升，較0 h、2 h分別增加17.35%、30.09%，隨后活性顯著下降，較6 h分別降低23.99%、51.77%。4 g/kg處后，隨著時間增加活性顯著下降，較0 h分別降低10.96%、29.40%、39.49%、47.74%。圖4

圖4 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜GSTs活性變化Fig.4 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on GSTs of Aphis gossypii

2.2 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化

2.2.1 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后AChE活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，2和4 g/kg處理AChE活性均表現(xiàn)為持續(xù)下降，在2 h時，2 g/kg處理高出CK 2.97%，其它時間均低于CK。4 g/kg處理在2～24 h各時間點活性分別下降31.60%、46.38%、51.41%、59.41%，與其它處理相比活性始終最低。圖5

圖5 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜AChE活性變化Fig.5 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on AChE of Acyrthosiphon gossypii

2.2.2 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CarE活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣處理棉花后，低劑量短時(6 h)對CarE活性有顯著誘導作用，高劑量則為持續(xù)抑制作用。噻蟲嗪2 g/kg處理在2 h、6 h分別較0 h提高25.77%、42.95%，隨后在12 h、24 h較6 h降低25.46%、51.53%。4 g/kg在6、12、24 h較2 h分別下降20.85%、29.52%、40.39%，且各時間點間差異顯著。圖6

圖6 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜CarE活性變化Fig.6 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CarE of Acyrthosiphon gossypii

2.2.3 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CYP450活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，2 g/kg處理活性在2 h達到最大，較0 h顯著提升7.45%，其它時間點間無顯著變化。4 g/kg處理活性在6 h達到最大，較2 h提高10.37%，2處理12～24 h對CYP450活性均無明顯影響。圖7

圖7 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜CYP450活性變化Fig.7 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CYP450 of Acyrthosiphon gossypii

2.2.4 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后GSTs活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣處理棉花后，2 g/kg處理GSTs活性先升后降，12 h內(nèi)各時間點無顯著差異，24 h較0 h降低61.86%，且顯著低于其它時間點。4 g/kg處理活性持續(xù)降低，2～24 h內(nèi)各時間點較0 h分別下降30.10%、41.41%、49.72%、61.87%，各處理間均有顯著差異。低劑量處理對GSTs活性短時(6 h)呈現(xiàn)有誘導作用，高劑量處理有持續(xù)抑制作用。圖8

圖8 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜GSTs活性變化Fig.8 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on GSTs of Acyrthosiphon gossypii

2.3 棉蚜和棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化

研究表明，棉蚜體內(nèi)各解毒酶活性均高于棉長管蚜，且在取食噻蟲嗪包衣棉花后上升速度也高于棉長管蚜。在取食噻蟲嗪包衣處理棉花植株的葉片前，棉蚜AChE、CarE、CYP450、GSTs的相對活力分別為棉長管蚜的4.62、2.51、1.08、1.51倍，除CYP450外，棉蚜解毒酶的相對活力均顯著高于棉長管蚜(P<0.05)。AChE相對酶活比在取食2 g/kg處理2 h內(nèi)激增，隨后隨時間逐漸下降，最終接近CK的相對酶活比，而4 g/kg處理相對酶活比除在6 h有所下降外，其余時間均呈上升趨勢。2 和4 g/kg處理CarE相對酶活比在2 h均有所下降，4 g/kg處理隨后開始上升并趨于穩(wěn)定，而2 g/kg處理在6～12 h激增，隨后下降，并在24 h高于其它處理。棉蚜和棉長管蚜的CYP450相對酶活在取食前接近，取食4 g/kg處理后下降，24 h時小于1.00，取食2 g/kg處理6 h內(nèi)兩者相對酶活比呈上升趨勢，隨后小幅下降，兩者存在顯著差異(P<0.05)。2 g/kg處理下2種蚜蟲的GSTs相對酶活比先上升后下降，而4 g/kg處理下，不同時間點相對酶活比高于2 g/kg及CK處理，且整體呈持續(xù)上升趨勢。圖9

注：相對酶活比=棉蚜比活力/棉長管蚜比活力Note：Relative ratio=Activity of Aphis gossypii/Activity of Acyrthosiphon gossypii圖9 棉蚜和棉長管蚜的相對酶活比變化Fig.9 Change of relative ratio between Aphis gossypii and Acyrthosiphon gossypii

3 討 論

乙酰膽堿酯酶(AChE)通過催化降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，終止其對神經(jīng)突觸后膜興奮的刺激作用，以維持神經(jīng)沖動在生物體內(nèi)的正常傳遞[18]。試驗結(jié)果表明，取食噻蟲嗪包衣棉花葉片后，低劑量處理時，棉蚜AChE活性呈現(xiàn)出時間效應，但對照處理棉蚜AChE活性有顯著上升，因此，推測這種現(xiàn)象可能是由棉蚜取食棉葉帶來的誘導效應，這種現(xiàn)象與曾賢義[19]用吡蟲啉處理煙蚜，曾春祥等[20]用吡蟲啉處理桃蚜后，兩者AChE表現(xiàn)出結(jié)果一致。兩者的AChE活力比在取食不同劑量處理24 h后均有所上升，相同劑量噻蟲嗪包衣棉花后棉蚜的AChE活性更高，尤其是在高劑量下兩者酶活比的增加幅度更大，而在預試驗中，棉蚜也表現(xiàn)出了對高劑量更好的耐受性。雖然明確噻蟲嗪作用靶標為乙酰膽堿受體[21,22]，但高劑量處理和棉長管蚜取食后均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

羧酸酯酶(CarE)可將含酯鍵、酰胺鍵、硫酯鍵等的外源物質(zhì)水解為相應的醇或酸[23]。此次試驗中噻蟲嗪低劑量處理短時對試蟲的CarE活性有持續(xù)的誘導作用，高劑量處理為顯著的持續(xù)抑制作用，在24 h均表現(xiàn)為顯著的抑制作用。石緒根[24]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，抗性棉蚜品系體內(nèi)的CarE表達量增加較小，與試驗中棉蚜和棉長管蚜在被處理后CarE活力比的變化結(jié)果相佐證。呂敏等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)植物次生物質(zhì)2-十三烷酮和槲皮素對棉蚜CarE分別具有顯著的誘導作用和劑量效應，實驗中棉蚜對照組CarE活力也出現(xiàn)了時間上的顯著波動，并在24 h時呈現(xiàn)出顯著的提高。噻蟲嗪種子包衣棉花對蚜蟲CarE的影響是多方面綜合的復雜結(jié)果，且受到時間和劑量的影響。

細胞色素P450(CYP450)是生命體藥物代謝過程中的主要蛋白酶，因酶蛋白中血紅素與CO結(jié)合在可見光450 nm處有最大吸收峰而得名[26]。試驗中棉蚜取食高劑量、棉長管蚜取食不同劑量噻蟲嗪包衣處理植株的棉葉CYP450活力變化較小，各處理組內(nèi)不同時間點多數(shù)差異不顯著。有報道[27,28]通過測定酶抑制劑增效作用，發(fā)現(xiàn)增效醚對新煙堿類藥劑具有顯著的增效作用，說明CYP450在昆蟲在對新煙堿類藥劑產(chǎn)生抗性的過程中發(fā)揮了顯著的作用，試驗中棉蚜取食低劑量處理后體內(nèi)CYP450活性得到了顯著的升高，兩者結(jié)論一致。另有研究表明，CYP450幫助昆蟲外源毒害物質(zhì)的代謝主要是通過部分有關(guān)蛻皮激素合成基因的過表達實現(xiàn)的[24]，而試驗中選取的棉蚜均為成蚜，體內(nèi)蛻皮激素含量低，可能使噻蟲嗪對CYP450的誘導作用有所降低。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是昆蟲體內(nèi)參與有毒物質(zhì)代謝的一類重要酶。試驗中蚜蟲取食低劑量噻蟲嗪包衣棉花對GSTs活性表現(xiàn)出先誘導后抑制的時間效應，這與袁家瑜等[29]用噻蟲嗪亞致死劑量處理月季長管蚜Macrosiphumroswomm表現(xiàn)出的時間效應一致。與王小強等[30]用吡蟲啉亞致死劑量處理豌豆蚜Acyrthosiphonpisum24 h內(nèi)的變化也相吻合。但與對照組相比，誘導效應并不顯著。此次試驗高劑量處理下2種蚜蟲均表現(xiàn)出持續(xù)的抑制作用，并且棉蚜在高劑量處理下GSTs的活力在不同時間點均高于棉長管蚜，且兩者的比值在不斷上升。史曉斌等[26]報道吡蟲啉抗性為42.19倍的棉蚜體內(nèi)GSTs活力是敏感棉蚜的1.58倍，在棉蚜對吡蟲啉的抗性產(chǎn)生中，GSTs的活力有所升高，但較為緩慢，與試驗中低劑量處理對GSTs的影響相同。GSTs可能參與棉蚜和棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后的代謝解毒，但不是主導因素。

與通過亞致死劑量處理后測定昆蟲體內(nèi)酶活力不同，試驗中的蚜蟲在進行生測前不斷取食會持續(xù)吸收毒害物質(zhì)。在這個過程中，對蚜蟲產(chǎn)生脅迫的不僅有噻蟲嗪，還有棉花體內(nèi)的抗蟲物質(zhì)，以及噻蟲嗪在植物體內(nèi)的代謝物質(zhì)和棉花被噻蟲嗪誘導產(chǎn)生的化學物質(zhì)，這些物質(zhì)都會影響昆蟲體內(nèi)酶的活性。明確噻蟲嗪包衣棉花對棉蚜和棉長管蚜解毒酶的影響，對生產(chǎn)中推廣新煙堿類藥劑種子處理棉種防治棉花蚜蟲具有一定的指導作用。

4 結(jié) 論

取食噻蟲嗪包衣棉花三葉期葉片，2 g/kg處理對棉蚜體內(nèi)CarE、CYP450、GSTs及棉長管蚜體內(nèi)CarE、CYP450的活性呈現(xiàn)先抑制后誘導的時間效應。4 g/kg處理對2種蚜蟲各解毒酶活性均表現(xiàn)出持續(xù)的抑制作用。田間同一地塊采集蚜蟲經(jīng)實驗室篩選3代后棉蚜AChE、CarE、CYP450、GSTs的相對活力分別為棉長管蚜的4.62、2.51、1.08、1.51倍，棉田棉蚜較棉長管蚜對毒害物質(zhì)具有較強的代謝能力。