晝夜節律紊亂對非酒精性脂肪性肝病及相關肝細胞癌的影響

朱金霞， 劉光偉， 楊培偉

1 河南中醫藥大學 第一臨床醫學院， 鄭州 450000；2 河南中醫藥大學第一附屬醫院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)組織學以彌漫大泡性肝細胞脂肪變性及脂肪聚集為特征，包括單純性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化、肝硬化及相關肝細胞癌(HCC)[1]。NAFLD現已成為HCC主要原因之一，且發病率以每年約10%的速度增長[2]。與經典的肝炎-肝硬化-肝癌三部曲所不同的是，約40%的NAFLD不經過肝硬化直接發展為HCC，其發病機制主要與代謝、遺傳、腸道菌群、胰島素抵抗(IR)、免疫、內分泌等途徑有關[3]。當前，人們受生活工作影響，熬夜、夜班較為普遍，晝夜節律不同步加之外部環境刺激增加了NAFLD相關HCC(NAFLD-HCC)發病率，而同步晝夜節律可延緩NAFLD-HCC進程。本文探討晝夜節律紊亂對脂質代謝、糖代謝及腸道菌群的影響，以期為NAFLD-HCC臨床診治提供幫助。

1 晝夜節律

晝夜節律是指機體各項生理指標的晝夜變化，是人體適應地球自轉形成的生理特征。穩定性和可塑性是晝夜節律的2個相輔相成的特征，體現出環境對人的影響。中樞神經系統經過長期的光照塑造控制各外周器官的晝夜節律，使人體內部節律與外部光照節律一致，稱為可塑性；穩定性指短期內機體各器官在基因層面形成一套不依賴外部光照的內源性翻譯轉錄調控機制，保證機體維持穩定的晝夜節律[4]。長期熬夜、夜間輪班，迫使機體適應新的環境光照，機體內部各器官出現暫時性晝夜節律不一致的情況，即晝夜節律紊亂。

分子生物學水平上，多個相互影響的生物鐘基因及其蛋白產物組成的轉錄-翻譯-負反饋回路形成近似24 h為周期的震蕩，再由輸出系統調節效應器形成晝夜節律[5]。哺乳動物的晝夜節律呈現出富有系統層次的特點，由中樞、外周2個生物鐘系統組成。下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)充當主起搏器發出神經節律信號，外周器官如肝、腎、胃、腸等接收其信號，協同SCN維持機體正常生理功能。哺乳動物的晝夜節律由多個自治反饋環控制(圖1)：(1)其中一條核心反饋環是由正調控基因[腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1基因(brain and muscle ARNT-like protein 1，BMAL1)、晝夜節律運動輸出周期故障基因(circadian locomoter activity kaput，CLOCK)]和負調控基因[周期基因(period，PER)、隱花色素基因(cryptochrome，CRY)]組成。晝夜節律自黎明開始，BMAL1和CLOCK形成復合物后，與啟動因子E-box DNA序列結合，啟動CRY、PER基因轉錄。晝夜節律白天結束點，CRY、PER蛋白水平升高至一定程度后在細胞質內被翻譯，結合酪蛋白激酶1δ(CK1ε/δ)形成PER:CRY異二聚體運輸至細胞核內抑制CLOCK-BMAL1活性。胞核內未形成PER:CRY的異二聚體PER和CRY則各自被腺苷酸活化蛋白激酶和CK1ε/δ磷酸化降解，此部分通過解除對CLOCK-BMAL1復合物的抑制而開始新一輪的轉錄[5]，從而形成一條完整的晝夜節律反饋環路。(2)除上述核心反饋環外，維甲酸相關孤兒受體α/β(retinoid acid receptor-related orphan receptor，RORα/β)與REV-ERBα/β(孤兒核受體家族成員)構成另一環路，CLOCK-BMAL1結合RORα/β激活正向轉錄，反之REV-ERBα/β競爭結合到同一位點RRE抑制轉錄[6]，形成第2條自主反饋環路。(3)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)由煙酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)生成，且NAD(SIRT1的底物)調節去乙酰化酶1(sirtuin1，SIRT1)，NAD的限速酶是NAMPT。CLOCK-BMAL1復合物結合E-box基因序列后上調NAMPT的表達，并在細胞核外的NAMPT生成NAD，達到上調SIRT1的目的，SIRT1入胞核后抑制CLOCK-BMAL1的表達[7]，簡稱SIRT1環路，形成第3條自主反饋環路。(4)DEC1/DEC2(分化型胚胎軟骨發育基因)的表達亦發揮節律基因的作用，DEC1/DEC2與BMAL1結合或與BMAL1-CLOCK競爭性結合E-box元件而抑制其自身轉錄[8]，形成第4條自主反饋環路。除以上環路外，由于E-box元件是關鍵的DNA反應原件，分布在下丘腦、肝臟等重要器官的各種節律基因的轉錄均被E-box調控，這些基因在控制晝夜節律的生理過程中發揮重要作用。

圖1 晝夜節律反饋環路

2 晝夜節律影響NAFLD-HCC脂質代謝

2.1 脂質代謝與NAFLD-HCC NAFLD-HCC脂質代謝受損的主要原因是多種原因導致肝細胞中甘油三酯(TG)異常累積，其中IR是最重要的影響因素。IR中胰島素在抑制脂肪細胞分解中的作用減弱，導致脂肪組織脂解，并增加肝臟對游離脂肪酸的吸收。同時，肝臟對TG的利用受到抑制，從而引起脂質在肝臟中沉積[9]。新生脂肪的形成源于肝臟中脂肪的積累。此外，線粒體功能障礙可能損害脂肪酸β氧化并導致脂質蓄積，通常發生在NAFLD之前。隨著脂肪酸β氧化或TG轉運受損，肝臟有效清除脂質的能力下降，可能最終導致NAFLD-HCC的進一步發展。

脂質代謝紊亂在NAFLD-HCC起始和進展中發揮關鍵作用。脂質代謝影響細胞的增殖和分化，可被各種腫瘤抑制基因調節；膽固醇合成酶角鯊烯單加氧酶(SQLE)通過調節膽固醇酯和活性氧促進NAFLD-HCC發生[10]。脂質脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)介導的肝脂質沉積導致小鼠移植腫瘤生長并自發形成肝癌，抑癌基因——鋅指同源盒2(ZHX2)通過逆轉LPL轉錄阻止細胞生長和NAFLD-HCC進程[11]。反之，肝臟特異性缺乏抑癌基因——蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)會促進肝脂肪細胞特異性基因及與β氧化有關的基因的表達及脂肪形成，進而導致NASH和HCC的發生[12]。

2.2 晝夜節律參與脂質代謝

晝夜節律基因通過控制動物和人類的脂質節律和血糖維持肝臟穩態。研究[13]顯示，159種脂質中有27種在肝臟中震蕩，并在主光期的時間門控下達到最高點，提示脂質代謝在肝臟中的積聚受時間控制。脂質的晝夜節律主要由SCN的下丘腦時鐘和肝臟、胰腺、肌肉和白色脂肪組織的外周時鐘控制。生物鐘基因如CLOCK-BMAL1、REV-ERBα/β、RORα/β、PER/CRY等是肝脂質代謝的關鍵調節因子。

2.2.1 CLOCK-BMAL1 CLOCK轉錄因子是下丘腦視交叉上核起搏器神經元內分子晝夜節律時鐘的關鍵組成部分，主要通過直接調節脂質代謝基因或影響線粒體活動調控脂質代謝。CLOCK突變小鼠特征是肝脂肪變性、肥胖、高TG血癥和高血糖癥，全天顯示脂質吸收增加。發現血漿TG不顯示晝夜節律，一天中水平都較高。以及其他脂質代謝調控基因的表達異常，如脂肪酸結合蛋白1(FABP1)、酰基輔酶A合成酶4(ACSL4)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)和LDL受體[14]。在動物實驗[15]中，CLOCK突變和BMAL1敲除小鼠表現出對高脂飲食喂養的敏感性增加、嗜食和超重，提示肝生物鐘基因療法能夠改善晝夜節律紊亂小鼠對高脂飲食介導的脂代謝損傷。果蠅CLOCK突變導致脂質代謝(二酰基甘油和酰基肉堿)減少、饑餓感增加，可能與線粒體活動受損有關[16]。BMAL1在調節脂肪儲存，利用和脂肪細胞分化中發揮重要作用。BMAL1敲除導致小鼠肥胖，食物攝入的晝夜節律發生變化，可能與脂肪細胞TG中不飽和脂肪酸數量的減少有關[17]。

2.2.2 REV-ERB、RORα REV-ERB作為核心節律基因可直接通過晝夜節律的方式抑制生脂基因。另一方面，REV-ERB可與肝細胞核因子共同作用調節脂質代謝，下丘腦REV-ERB核受體可控制飲食誘發的肥胖小鼠的晝夜食物攝入量和瘦素(一種生脂基因)敏感性，REV-ERB與肝細胞核因子6協同作用可調節成年小鼠肝脂質代謝[18]。BALB/c小鼠長期服用REV-ERB激動劑SR9011/SR9009時，可見脂肪含量明顯減少，體質量減輕，血脂改善[19]。此外，REV-ERBα可改變表觀遺傳，進而調節肝脂質代謝，隨后募集組蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)，并誘導染色質重塑和組蛋白修飾。在動物[20]實驗中，REV-ERBα/HDAC3敲除小鼠表現出嚴重的肝脂肪變性，與新生脂肪形成增加和胰島素敏感性更高有關；低REV-ERBα水平會降低HDAC3在活性/進食期間與肝臟基因結合的能力，從而使脂質脂肪生成；相反，在靜息/禁食期間，升高的REV-ERBα水平會增強HDAC3向肝臟代謝基因的募集，從而阻礙脂質的生成。REV-ERBα基因敲除小鼠的肝臟中極低密度脂蛋白水平升高，載脂蛋白C3基因表達升高[21]。綜上可見，肝REV-ERB敲除小鼠可表現出明顯的肝脂肪變性。

RORα可通過各種抗炎途徑影響NAFLD-HCC的代謝損傷。RORα及其配體可誘導超氧化物歧化酶2(SOD2)、谷胱甘肽過氧化酶1(GPx1，一種氧化應激反應因子)的表達，減少肝氧化應激和炎癥反應，并減輕小鼠的NASH[22]。研究[23]表明，RORα可增強肝巨噬細胞中的M2極化，通過分泌抗炎和免疫調節性細胞因子IL-10保護肝細胞免受損傷。同時還發現RORα的髓樣特異性敲除可增強肝臟對高脂飲食誘導的NASH的敏感性。此外，RORα活化劑通過誘導Krüppel 樣因子(KLF)4增強肝巨噬細胞的M2極化并延緩NASH的進展。

2.2.3 PER/CRY PER基因主要通過抑制過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)γ的活性或調節脂肪前體細胞KLF15控制脂質代謝：(1)PER2是白色脂肪組織中正常脂質代謝所必需的。PER2可通過充當其天然調節劑，控制PPARγ的促脂肪形成活性，進而控制脂質代謝[24]。(2)PER3可與Klf15發生串擾，從而調節內源性抗原呈遞細胞中的脂肪形成[25]。CRY敲除可增加飲食誘導的肥胖易感性，CRY1/2敲除小鼠相較于野生型小鼠，在同樣的高脂飲食下更易且更快發生肥胖，且白色脂肪組織中與脂質攝取和脂肪生成相關基因[FAS、乙酰輔酶A羧化酶基因(ACC1)、ACSL4、二酰基甘油酰基轉移酶基因(DGAT)1、2等]的表達上調[26]。

Arble等[27]研究顯示，12 h光照期喂食高脂食物的大鼠相較于12 h黑暗期喂食組，體質量增加2.5倍；而正常明暗周期下喂食的大鼠體質量增加相對減少，其代謝和激素的日常節律更可控[28]。與不進食的大鼠相比，有時間限制的喂食(在活動階段進食10 h)可恢復代謝節律并保護CLOCK突變的大鼠不肥胖[29]，該研究有力證實了晝夜節律對脂質代謝的廣泛影響。反之，肥胖患者中BMAL1、CRY1、CRY2和PER2基因的表達白天顯著增加，夜晚下調，表明晝夜節律的基因表達及其下游途徑也受到脂質代謝紊亂的影響[30]。晝夜節律基因調節脂質代謝過程中的轉運蛋白及有關限速酶的表達，以及脂質代謝反過來影響節律基因的表達，均影響NAFLD-HCC的進展。

3 晝夜節律與糖代謝

盡管直接的葡萄糖信號傳導是人體適應葡萄糖可利用性快速變化的主要過程，但生物鐘似乎可為規律性復發事件(例如夜間饑餓后的食物攝取)提供節律性基線調整。許多糖代謝相關過程，例如胰島素和胰高血糖素的分泌以及葡萄糖的產生和攝取，均呈現出強烈的晝夜節律性。由于機體各組織均受到中央起搏器和外周生物鐘的影響，晝夜節律對糖代謝的影響包括全身基因敲除和局部組織基因敲除。中央起搏器SCN病變打亂了血糖、胰島素和胰高血糖素的晝夜節律變化[31]。生物鐘基因的組織特異性敲除在外周震蕩器中有同樣重要的作用，根據組織的不同，效果也不同。腸道中的外周時鐘可調節葡萄糖的吸收，肌肉、脂肪組織和肝臟中的外周時鐘可調節局部的胰島素敏感性，而胰腺的外周時鐘可調節胰島素的分泌[32]。晝夜節律基因中，與糖代謝相關研究最多的基因是BMAL1。研究[33]表明，BMAL1全身敲除可導致葡萄糖刺激的ATP產生嚴重缺陷，導致胰島素分泌減少，并證實了抑制解偶聯蛋白2(UCP2)可以改善BMAL1缺失所致的葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)的減少。胰腺胰島具有自我維持的晝夜節律基因和轉錄因子BMAL1和CLOCK的蛋白質震蕩。晝夜節律突變小鼠中與生長、葡萄糖代謝和胰島素信號傳導有關的胰島基因的震蕩階段被延遲，BMAL1和CLOCK突變均顯示葡萄糖耐量受損，胰島素的分泌減少[34]。除胰腺自身的晝夜節律外，骨骼肌、肝臟外周組織特異性缺失BMAL1小鼠的葡萄糖代謝和全身葡萄糖穩態也受到損害。肌肉特異性BMAL1敲除小鼠實驗[35]證實，肌肉生物鐘的生理作用是為肌肉細胞從休息/禁食階段到活動/進食階段的過渡做準備，為能量供應和需求的周期性波動建立基礎。而肌肉特異性BMAL1敲除和隨之而來的肌肉時鐘紊亂將導致代謝水平降低，其特征是肌肉胰島素抵抗和葡萄糖代謝紊亂。由此可見，肌肉BMAL1缺失與胰島素敏感性降低和葡萄糖氧化有關。肝臟BMAL1敲除小鼠在胰島素正常產生和血脂異常(高循環游離脂肪酸和高肝TG水平)的情況下，禁食期間表現出低血糖癥，并清除了更多的葡萄糖[36]。小鼠肝臟中，BMAL1表達被KLF的三鋅指家族成員轉錄抑制。KLF10可感知細胞內葡萄糖水平，其功能主要是通過脂肪生成、糖酵解和糖異生調節肝臟代謝。KLF10在野生型小鼠肝臟中顯示出強大的晝夜節律表達模式，BMAL1敲除小鼠中并無此模式，發現BMAL1調節KLF10在小鼠中的晝夜節律表達，BMAL1缺失導致糖脂代謝紊亂[37]。與上述研究不同的是，有研究[17]發現脂肪組織中選擇性缺乏BMAL1的小鼠體質量增加，但局部胰島素敏感性正常。

4 晝夜節律與腸道菌群

研究[38]發現，腸道菌群的組成、相對豐度及功能均呈晝夜震蕩，其周期與人的中央生物鐘相同(24 h)，進食節律可調節宿主生物鐘組成或時差誘導所致的腸道菌群晝夜波動及功能異常。晝夜節律主要通過宿主的進食節律、飲食結構影響腸道菌群：(1)有節律的進食導致腸道菌群發生震蕩，宏觀基因組波動的原因可能是某類菌群有節奏地占據生態位，而生態位可對饑餓或進食做出回應。進食節律受損引起的PER1/2缺失導致腸道菌群發生晝夜波動，糞菌移植給無菌小鼠會導致葡萄糖不耐受和肥胖的發生[38]。Zarrinpar等[39]研究顯示，飲食引起的肥胖小鼠腸道菌群的節律性波動可通過限時喂養恢復，進食節律為腸道菌群的節律提供動力，如黑暗期首先進食的是夜間齲齒動物；相對而言，PER1/2雙敲除小鼠晝夜進食節律明顯減弱，可見腸道菌群的節律減弱是進食時間改變導致的。(2)飲食結構：在小鼠“人工晝夜”中，低脂或高脂飲食的無菌小鼠表現出明顯的中樞和肝臟晝夜節律基因表達受損，高脂飲食導致微生物的alpha多樣性(反映菌群的多樣性)改變，Shannon指數顯著降低(指數高則菌群多樣性高)，表明高脂飲食下晝夜節律的菌群豐度被抑制，且節律震蕩減弱[40]。(3)此外宿主生物鐘調節因子亦影響菌群在腸道內的定植。腸道菌群在明暗循環中表現出節律性，生物鐘調節因子(褪黑激素)通過重新編程腸道菌群而改善宿主脂質代謝。腸道菌群中的29種菌種的組成和豐度與肝臟中的節律基因表達相關，具體而言與CLOCK、CRY1、PER2等基因表達呈正相關，而與PER1和CRY2表達呈負相關，表明腸道菌群與生物鐘基因和血清脂質水平相關[41]。反之，宿主的晝夜節律和脂質代謝也受到腸道菌群的影響，腸道菌群通過影響循環信號、腸內神經元和迷走神經傳入信號，向大腦傳遞饑餓和飽足信號，參與食物攝入和喂養節律的晝夜調節，從而影響脂質代謝[38]。腸道菌群通過HDAC3控制脂質吸收的同時編程小鼠晝夜代謝節律[42]。

綜上所述，晝夜節律和腸道菌群影響脂質代謝相關疾病的進展，提示臨床中因腸道菌群失衡所致的NAFLD相關疾病可從規范節律性飲食角度考慮。

5 晝夜節律與NAFLD-HCC

晝夜節律基因在調節細胞周期、免疫檢查點確定、基因組穩定性和DNA修復中對NAFLD-HCC病程進展起關鍵作用。在CLOCK突變、CRY1/2雙基因敲除小鼠實驗[43]中發現，從G2到M過渡的細胞周期進程的Wee1因子的晝夜節律表達被破壞。生物鐘基因NPAS2(神經元PAS結構域蛋白2)可在HCC中過表達，并通過在體外和體內促進細胞增殖和抑制線粒體相關的內在凋亡來誘導細胞存活。轉錄上調CDC25A磷酸酶(細胞周期調節因子)可刺激NPAS2表達。此外，BMAL1/NPAS2異源二聚體可與CDC25A啟動子區域中的E-box元件結合，并參與HCC中NPAS2介導的腫瘤細胞存活[44]。在動物實驗[45]中，PER/CRY基因敲除小鼠可形成少量但體積較大的NAFLD誘導的HCC，50周齡時被首次發現；BMAL1敲除小鼠形成的瘤體數量增加，但在70周齡時發現的HCC體積較小；慢性時差會增加PER/CRY基因敲除小鼠的HCC數量和大小；兩種性別BMAL1突變小鼠HCC發生風險均升高，且雄性較雌性更高。近年來，腫瘤免疫逃逸理論盛行，而晝夜節律是優化免疫反應的關鍵因素：即免疫細胞的內在節律性調節與外部環境之間的相互作用可優化免疫反應。研究[46]發現，晝夜節律的核心負調節因子(PER1/2/3、CRY1/2)在許多腫瘤中表達均下調，該現象與T淋巴細胞衰竭以及免疫抑制分子(程序性死亡配體1和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4)的整體上調顯著相關。

6 從晝夜節律出發對NAFLD-HCC的臨床指導

晝夜節律通過各種途徑影響NAFLD-HCC的進展，據此，為達到影響最小化，需要采取合理而有效的干預方式：(1)優化輪班工作時間并減少社會性時差，保證睡眠時間和質量；(2)限制進食時間，減少夜宵等夜間食物攝取；(3)注意營養調節，改變膳食比例，均衡飲食；(4)合理開展有氧運動。現實中應通過各種措施督導患者，減緩NAFLD-HCC病情的進展。

7 小結

通過梳理近年關于晝夜節律系統影響NAFLD-HCC的研究進展，可以提升對晝夜節律基因在調節脂質代謝、糖代謝及腸道菌群中對NAFLD-HCC影響的認識。雖然目前已證實晝夜節律紊亂與NAFLD-HCC發病率增加有關，但其機制在疾病發展中所占比重仍很難評估。因此，需要進一步研究晝夜節律參與代謝、致病過程中的分子途徑，不僅要為治療提供靶點，更重要的是防病于未然，更好地改善公眾健康。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：朱金霞負責設計課題，分析資料，撰寫論文；楊培偉負責數據收集，修改論文；劉光偉負責擬定寫作思路，指導文章寫作及最終定稿。