電刺激對背根神經節和雪旺細胞髓鞘化的影響

雷濤，劉玉紅，張煜，梁卓文

1.空軍軍醫大學生物醫學工程系，陜西西安710032；2.空軍軍醫大學口腔醫院口腔科，陜西西安710032；3.聯勤保障部隊解放軍第901醫院，安徽合肥230031；4.空軍軍醫大學西京醫院，陜西西安710032

前言

促周圍神經系統的髓鞘化在周圍神經損傷的修復中扮演著重要作用，而周圍神經系統的髓鞘化過程是由多因素調節的髓鞘形成細胞-雪旺細胞（SCs）與軸突之間復雜的相互作用過程［1-3］。在腕管綜合征引起的正中神經損傷患者術后給予電刺激治療，證實短暫低頻的電刺激治療可顯著促進神經再生，刺激神經支配區域的感覺和運動功能，但具體機制不清楚［4-5］。因此，建立體外的背根神經節（DRG）-SCs-電刺激模型可為研究電刺激促周圍神經成髓鞘機制提供基礎。

本文設計了一種電刺激細胞培養系統，該系統具備組裝簡單、高透明性、可滑動拆卸玻片的特點，可用于各種成像設備的觀察，無須轉移和破壞細胞。該系統可用于DRG-SCs-電刺激模型。

1 材料和方法

1.1 電刺激細胞培養系統的設計

電刺激細胞培養系統包括函數發生器（安捷倫科技公司）和電刺激小室（自制）（圖1a）。函數發生器產生波幅為6 Vp-p、頻率為10 Hz 矩形波（圖1b）。電刺激小室從上到下共由5 個部分組成：聚苯乙烯蓋（Biologix, 中國）、中空聚苯乙烯室（Biologix, 中國）、生物相容性墊片（Biologix, 中國）、導電玻璃（58 mm×25 mm×1 mm, 顧洛公司,中國）和聚苯乙烯夾具（Biologix，中國）（圖1a）。中空的聚苯乙烯室被生物相容性墊圈包圍，導電玻璃在中空聚苯乙烯室的下方。聚苯乙烯夾具固定中空聚苯乙烯室和導電玻璃，防止培養基外流。電刺激小室可根據實驗設計進行串聯或并聯電路。在本研究中，將3個電刺激小室用銅線和導電夾并聯，用于多個樣本的電刺激干預（圖2）。

圖1 電刺激細胞培養系統Fig.1 Electrical stimulation(ES)cell culture system

圖2 電刺激小室Fig.2 ES chamber

1.2 細胞培養

1.2.1 DRG培養從新生1天SD大鼠收集DRG，剪碎后加入0.5 mL膠原酶、1 mL 0.25%胰蛋白酶（不含乙二胺四乙酸）及1 mL DME/F12（HyClone,USA）消化1 h，用40 μm微孔過濾器過濾后終止消化。以500 g/min的轉速離心5 min。將細胞懸浮在含有10%胎牛血清（FBS）的DME/F12培養基（Gibco,USA）中，然后將細胞懸液以3×105個細胞的密度接種在電刺激小室的導電玻璃上。培養24 h 后，更換培養基，用Neurobasal（Gibco,USA）+B27（Gibco, USA）+NGF（50 ng/mL）（R&D Systems,USA）+5-FU（31 μmol/mL）（HSRVEY,USA）培養48 h，去除非DRG細胞，在不含5-FU的培養基中繼續培養3 d，以備實驗使用［6］。

1.2.2 SCs培養從新生1 天的SD 大鼠收集雙側坐骨神經，剪碎后置入5 mL 離心管中，隨后加入1 mL 膠原酶、1 mL 0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）和1 mL DME/F12 進行消化。消化30 min，以500 g/min 的轉速離心5 min。將細胞懸浮在含10% FBS 血清的DME/F12 培養基中，37 ℃培養24 h，然后用含5-FU（31 μmol/mL）、Forskolin（10 μmol/mL）和10%FBS血清的DME/F12 培養液純化48 h，再改為含Forskolin（10 μmol/mL）和10% FBS 血清的DME/F12 培養液培養48 h，以備實驗用［6］。

1.2.3 DRG/SCs 共培養將SCs 用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA），消化5 min，500 g/min 的轉速離心5 min后使用含10% FBS 血清的DME/F12 培養液重懸，吸除導電玻璃培養板的培養液，將SCs 以2×105的密度接種于培養DRG 的電刺激小室中培養24 h。之后更換為Neurobasal+B27+NGF（50 ng/mL）+5%FBS培養液培養。

1.3 電刺激方案

電刺激小室在使用前經超聲波清洗、洗滌、干燥，然后進行紫外線照射消毒（12 h）。消毒后，用多聚賴氨酸包被導電玻璃表面3 h。DRG/SCs 共培養24 h 后分為對照（Ctrl）組和電刺激（ES）組。ES 組給予矩形波電刺激，波幅6 Vp-p，頻率10 Hz，1 h/d，7 d。Ctrl組無電刺激。Ctrl組和ES組的培養基每2 d更換1 次。在整個過程中，電極與培養基和細胞不接觸，導電玻璃的導電性能正常。

1.4 細胞毒性檢測

檢測導電玻璃培養系統是否對細胞產生毒性，DRG/SCs 共培養7 d 時，ES 組和Ctrl組細胞樣品分別轉移至96孔板，在37 ℃，5%CO2培養箱培養24 h，再向每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8（CCK8）溶液，繼續培育1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.5 免疫熒光檢測

DRG/SCs 細胞的髓鞘形成由髓磷脂堿性蛋白（MBP）的免疫熒光標示，神經元網絡以神經微絲蛋白200（NF200）標示。在第7 天，將DRG/SCs 細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。抗MBP 一抗（BIOSS, 中國）和抗NF200 一抗（Abcam, 英國）在4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次。避光加入羊抗鼠IgG-488(1：600)二抗、羊抗兔IgG-Cy3（1：600）二抗。用PBS 洗滌3 次后，在萊卡倒置熒光顯微鏡成像系統下觀察細胞。隨機選擇5 個視野。用ImageJ 軟件分析熒光強度和面積。熒光密度由熒光強度除以面積得到。

1.6 統計學分析

結果以均值±標準誤表示，P<0.05認為結果有統計學差異。數據用SPSS 20.0.0統計軟件進行分析。每個實驗至少重復3次。組間比較采用獨立樣本t檢驗分析。

2 結果

CCK8 細胞毒性結果顯示（圖3），ES 組的光密度（OD）值略高于Ctrl 組，但兩組之間無統計學意義（P>0.05）。因此，證實導電玻璃培養體系對神經細胞無毒性。

圖3 7天的電刺激對DRG/SCs細胞毒性的影響Fig.3 Effects of 7-day ES on the cytotoxicity of DRG/SCs

半定量結果顯示ES組MBP熒光強度明顯高于Ctrl組（P<0.01）（圖4）。圖5為Ctrl組和ES組DRG/SCs細胞的MBP蛋白免疫熒光。神經元網絡以NF200染色表示（綠色），髓鞘段以MBP染色表示（紅色）。

圖4 Ctrl組和ES組MBP熒光強度的半定量結果Fig.4 Semi-quantitative results of fluorescence intensity of MBP in control group and ES group

圖5 Ctrl組和ES組DRG/SCs細胞的MBP免疫熒光Fig.5 Immunofluorescence of MBP in DRG/SCs in control groups and ES groups

3 討論

實驗結果表明，本文設計的電刺激細胞培養系統對神經細胞安全無毒，連續7 d 的電刺激可提高神經髓鞘化率。

周圍神經損傷的自愈能力有限，導致肌肉組織相應萎縮，功能喪失［7-8］。電刺激可以直接促進軸突生長，提高神經修復的速度和成功率［9-10］。同時，電刺激可以增加SCs的活性和神經營養因子的分泌，但具體的分子機制尚不清楚［11-14］。建立一個簡單、有效、可重復的電刺激細胞培養系統，對于研究神經細胞與電流的相互作用機制，制定有效的臨床電刺激治療參數尤為重要。與以往報道的電刺激設備相比［15-17］，本研究中的電刺激培養系統組裝簡單，電極不與培養液和細胞接觸，不會產生毒性。另外，該系統電流均勻，高清晰度的導電玻璃可以滿足各種檢測成像要求。此外，通過使用串聯或并聯的電刺激室，可以滿足不同種類的實驗需求。

4 結論

綜上所述，本文設計的電刺激培養系統組裝方便，操作簡單，價格低廉，可用于各種不同的實驗應用。該系統對神經細胞共培養成髓鞘有明顯的刺激作用，為研究神經與電信號的關系提供了良好的實驗平臺。