HPLC-DAD法同時(shí)測定正柴胡飲顆粒中9個(gè)活性成分的含量

劉 明，尹 強(qiáng)，趙 雷，高晶德

（1. 大連市第三人民醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116000；2. 大連市友誼醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連116000；3. 大連市第六人民醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116000；4. 大連市第七人民醫(yī)院藥劑科；遼寧 大連 116000）

正柴胡飲顆粒是由柴胡、陳皮、防風(fēng)、甘草、赤芍和生姜6味藥材制備而成的中藥制劑，具有發(fā)散風(fēng)寒，解熱止痛之功效。臨床常用于外感風(fēng)寒所致的發(fā)熱惡寒、無汗、頭痛、流感初起等癥[1]。柴胡具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣的作用[2]；陳皮具有理氣健脾，燥濕化痰的作用[3]；防風(fēng)主治外感風(fēng)寒、周身疼痛、頭痛目眩、風(fēng)寒濕痹、骨節(jié)疼痛等證[4]；赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛、清瀉肝火等作用[5]；甘草主要有益氣補(bǔ)中、祛痰止咳、清熱解毒、調(diào)和諸藥等作用[6]。正柴胡飲顆粒收載于中國藥典2020年版一部，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對赤芍的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制[1]，相關(guān)文獻(xiàn)對其他幾味藥材中有效成分質(zhì)量控制的報(bào)道較少，且涉及藥材較單一[7-9]。本研究以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷為指標(biāo)成分，建立一種簡便、準(zhǔn)確、可行的HPLC法同時(shí)測定正柴胡飲顆粒中上述9個(gè)成分含量的方法，為完善正柴胡飲顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

LC2030C3D高效液相色譜儀（日本島津），DAD檢測器；Agilent TC-C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；XSR225型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多）；H66MC超聲清洗機(jī)（無錫超聲電子設(shè)備有限公司）；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)（美國默克密理博）。

1.2 材料

正柴胡飲顆粒（中國中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥廠，規(guī)格：10 g/袋，批號：20190506，20191121，20190808）；正柴胡飲顆粒（精華制藥集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：10 g/袋，批號：4112326，4112420，4112411）；柴胡皂苷a對照品（批號：110778-201912，純度：94.8 %）、柴胡皂苷d對照品（批號：110778-201912，純度：96.3 %）、橙皮苷對照品（批號：110721-201818，純度：96.2 %）、升麻素苷對照品（批號：111522-201913，純度：94.6 %）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號：111523-201811，純度：97.4 %）、甘草苷對照品（批號：110726-201819，純度：99.8 %）、甘草酸銨對照品（批號：110731-202021，純度：96.2 %）、甘草次酸對照品（批號：110723-201715，純度：99.6 %）、芍藥苷對照品（批號：110736-201943，純度：95.1 %）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥苷、甘草苷、甘草次酸和甘草酸銨對照品適量，置入100 ml量瓶，加甲醇溶解制成每1 ml含橙皮苷211.1 μg、芍藥苷465.7 μg、甘草苷288.3 μg、升麻素苷148.7 μg、甘草酸銨194.4 μg、甘草次酸90.7 μg、柴胡皂苷a 123.5 μg、柴胡皂苷d 81.7 μg和5-O-甲基維斯阿米醇苷84.4 μg混合對照品儲備液。精密量取儲備液5 ml置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 正柴胡飲顆粒適量，研細(xì)，稱取約0.5 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，加入甲醇約30 ml，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）20 min后取出，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按照正柴胡飲顆粒的處方比例，分別制備缺柴胡、陳皮、防風(fēng)、甘草和赤芍的陰性樣品，并按“2.1.2”方法，分別制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 0.02 %甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，25 %→47 %A；10～22 min，47 %→65 %A；22～45 min，65 %→33 %A；45～53 min，33 %A→25 %A；53～70 min，25 %A），流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；檢測波長采用波長切換法（0～7 min，283 nm；7～13 min，230 nm；13～38 min，254 nm；38～56 min，210 nm；56～70 min，254 nm）。

2.3 專屬性試驗(yàn)

在上述色譜條件下，分別測定對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液。結(jié)果對照品溶液基線平穩(wěn)，9個(gè)指標(biāo)成分分離良好；供試品溶液在柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷相應(yīng)色譜峰保留時(shí)間處均有檢出，各色譜峰理論塔板數(shù)均＞4000，色譜圖詳見圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對照品儲備液0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10.0 ml，分別置入50 ml量瓶，加甲醇溶液定容，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以各成分峰面積（Y）對各成分質(zhì)量濃度（X，μg/ml）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。同時(shí)逐級稀釋混合對照品溶液，以信噪比不小于10確定定量限。9個(gè)指標(biāo)成分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限見表1。

表1 9個(gè)指標(biāo)成分的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 儀器精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.59 %，1.07 %，0.66 %，1.17 %，0.43 %，1.22 %，0.80 %，1.14 %，0.94 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.2 中間精密度試驗(yàn) 另一名檢驗(yàn)人員使用Waters2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備對照品溶液及6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷的RSD均小于2.0 %（n=6）。同時(shí)計(jì)算兩名檢驗(yàn)人員間12份樣品溶液中9種活性成分含量的RSD值，分別為1.77 %，1.85 %，1.69 %，1.64 %，1.42 %，1.71 %，1.54 %，1.69 %，1.29 %（n=12）。表明本方法中間精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取正柴胡飲顆粒（批號：4112326），按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法平行制備6份溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析并計(jì)算各成分含量及其RSD值。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷的平均含量分別為1.3241，0.8477，2.2701，1.5264，0.8567，3.0415，2.0073，0.9546和4.8562 mg/g，RSD分別1.30 %，0.87 %，0.69 %，1.44 %，1.03 %，1.17 %，1.31 %，1.66 %，0.49 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取正柴胡飲顆粒（批號：4112326）按“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.36 %，0.94 %，1.52 %，0.81 %，1.51 %，1.23 %，0.75 %，1.14 %，1.49 % （n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量樣品6份（樣品批號：4112326），每份約0.25 g，精密稱定，分別置50 ml量瓶中，精密加入“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品儲備液2.5 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 9個(gè)成分的加樣回收率（n=6）

表2（續(xù)）

2.9 樣品測定

取各批次正柴胡飲顆粒樣品適量，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算各批次樣品中9個(gè)指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 正柴胡飲顆粒中9個(gè)指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

現(xiàn)代藥理研究表明[2-6]，柴胡中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d、陳皮中的橙皮苷、防風(fēng)中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷、赤芍中的芍藥苷、甘草中的甘草苷、甘草酸銨和甘草次酸是各藥材中主要活性成分，且《中華人民共和國藥典》2020年版一部收載的柴胡、陳皮、防風(fēng)、甘草和赤芍分別以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷作為指標(biāo)成分對藥材質(zhì)量進(jìn)行控制[1]。

3.2 色譜條件的考察

采用DAD檢測器在190～400 nm全波長掃描光譜圖，發(fā)現(xiàn)芍藥苷、甘草苷的最大吸收在233 nm附近，橙皮苷最大吸收在281 nm附近，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、甘草次酸最大吸收在257 nm附近，柴胡皂苷a、柴胡皂苷最大吸收在208 nm附近。筆者參考各藥材標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)下各成分的檢測波長，最終采用波長切換法，在0～10 min檢測波長為283 nm（檢測橙皮苷），10～20 min檢測波長為230 nm（檢測芍藥苷和甘草苷），20～45 min檢測波長為254 nm（檢測升麻素苷、甘草酸銨和甘草次酸），45～62 min檢測波長為210 nm（檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d），62～70 min檢測波長為254 nm（檢測5-O-甲基維斯阿米醇苷）。考察了乙腈-水、甲醇-水及乙腈與不同濃度的甲酸、磷酸水溶液的流動相體系[10-14]。結(jié)果，乙腈的洗脫能力優(yōu)于甲醇，故選擇乙腈作為流動相中的有機(jī)相；以乙腈-0.02 %甲酸水溶液作為流動相時(shí)基線平穩(wěn)，可有效改善升麻素苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的拖尾現(xiàn)象，提高待測成分與相鄰色譜峰的分離度。

試驗(yàn)考察了Agilent TC-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Thermo Accucore C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和Kromasil C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）對色譜峰的影響，結(jié)果表明，9種活性成分均能完全分離且峰型較好，其中Agilent TC-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）效果最佳，表明本試驗(yàn)方法對色譜柱的選取范圍較廣。考察了不同柱溫（25～35 ℃）對色譜峰的影響，結(jié)果表明，柱溫25 ℃時(shí)，各色譜峰峰型最佳。考察了不同流速（0.8～1.2 ml/min）對色譜峰的影響，結(jié)果1.0 ml/min時(shí)，各色譜峰的出峰時(shí)間和峰型最佳。以上考察表明，本方法耐用性較好。

3.3 小結(jié)

結(jié)果顯示，9個(gè)指標(biāo)成分為兩個(gè)廠家不同批次正柴胡飲顆粒的共有成分，6批樣品中的含量最高的是芍藥苷，均符合《中華人民共和國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)建立了 HPLC-DAD 法同時(shí)測定正柴胡飲顆粒中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨、甘草次酸和芍藥苷9個(gè)活性成分的分析方法，方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為正柴胡飲顆粒的質(zhì)量研究提供了更加全面的方法。