一株菲降解細菌產(chǎn)生生物表面活性劑特性的研究

閻潔，余雪巍，李鑒博，顧海萍，郭二輝

河南農(nóng)業(yè)大學林學院，河南 鄭州 450002

近年來，由于工業(yè)化的快速發(fā)展，多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）成為水體、土壤等環(huán)境中最主要的持久性有機污染物之一（Seo et al.，2009）。PAHs是由兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀、簇狀排列在一起的稠環(huán)形化合物，具有致癌、致畸、致突變效應(yīng)和難降解性，主要來源于化石燃料的不完全燃燒、采油等工業(yè)過程（顧海萍，2016）。由于PAHs本身具有高度親脂的特性，環(huán)境中低濃度的PAHs可通過食物鏈的生物放大作用威脅人體健康（Abd-Elsalam et al.，2009），PAHs污染的修復迫在眉睫。目前PAHs污染修復技術(shù)主要包括物理法、化學法和生物法3種，其中物理法有蒸汽抽提、熱脫附、超聲波、隔離法和換土法等，化學法有光催化法、濕式氧化法、電化學氧化法和化學淋洗法等，這些物理化學修復方法不僅成本高昂、修復不徹底還可能造成二次污染（錢翌等，2013）。生物修復是利用微生物自身的生長代謝來降解有機污染物的一種經(jīng)濟有效的方法，它具有可持續(xù)性和環(huán)境友好性（Masakorala et al.，2013）。然而，PAHs在環(huán)境中難溶、生物可利用性低是限制微生物修復有機污染物的關(guān)鍵問題（Xia et al.，2014）。生物表面活性劑是微生物生長代謝產(chǎn)生的一類同時含有親水基團和疏水基團的大分子化合物（Sun et al.，2019），因其能夠提高PAHs的生物可利用性而受到廣泛關(guān)注（Pacwa-Plociniczak et al.，2016）。但是生物表面活性劑產(chǎn)量低、純化難、生產(chǎn)成本高，使其在PAHs污染修復中推廣困難，促使直接篩選產(chǎn)生生物表面活性劑的PAHs降解菌株成為新的研究思路（Xu et al.，2020）。

由3個稠合苯環(huán)組成的菲已被美國環(huán)境保護署（USEPA）列為優(yōu)先污染物，它具有PAHs的典型結(jié)構(gòu)——k區(qū)和灣區(qū)，常被作為PAHs降解研究的模式化合物（Seo et al.，2009）。張俊葉等（2017）的研究顯示，與其他國家相比，我國表層土壤中USEPA優(yōu)先控制的16種PAHs以菲的含量最高，這嚴重威脅到我國的糧食安全和國民健康。因此，本研究選取菲作為目標污染物，從河南省信陽市一處多年垃圾焚燒場地中篩選分離出一株既能降解菲又能產(chǎn)生生物表面活性劑的細菌 GHP1，評價了該菌株的菲降解能力，鑒定了菌株所產(chǎn)生的生物表面活性劑類型，探討了菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的最佳生長條件，為PAHs污染微生物修復提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本實驗篩選菌株的土壤采自河南省信陽市一處有 50年歷史的垃圾焚燒場地（32.241°N，114.499°E），采樣深度為0—15 cm的表層土壤，土樣自然風干后過2 mm篩，并于4 ℃下保存。根據(jù)中國農(nóng)業(yè)化學委員會（1983）的方法分析該土壤的基本理化性質(zhì)如下：pH、有機物和陽離子交換容量分別為 6.5、14.1 g·kg?1和 26.4 cmol·kg?1，機械組成為49.1%的沙粒、14.2%的粉粒和36.7%的粘粒。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

菲（純度>99%，Sigma-Aldrich，上海），4000 mg·L?1的菲母液（丙酮溶），實驗中其他有機試劑均為色譜純，無機化學試劑均為分析純。

LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，1000 mL蒸餾水，pH 7.2，固體LB需添加 1.5%瓊脂。無機礦質(zhì)培養(yǎng)基（MSM）：1 g KH2PO4，0.5 g NaNO3，0.2 g MgSO4，0.5 g(NH4)2SO4，0.02 g CaCl2，1 g NaH2PO4·H2O，1000 mL蒸餾水，pH 6.5，固體MSM需添加1.5%瓊脂。所有培養(yǎng)基用前均經(jīng)過 121 ℃高壓蒸汽滅菌處理15 min。

1.3 菲降解和產(chǎn)生生物表面活性劑菌株的篩選

吸取2.5 mL菲母液于250 mL的錐形瓶內(nèi)并使丙酮揮發(fā)形成菲膜，再加入 100 mL滅菌的液體MSM，使菲的初始濃度為100 mg·L?1。稱取10 g土壤樣品于錐形瓶中，在 28 ℃、130 r·min?1的條件下震蕩培養(yǎng)一周，該過程為第一次馴化。然后，將10 mL瓶內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移到新的含菲膜的錐形瓶中，添加90 mL滅菌的液體MSM，繼續(xù)培養(yǎng)一周，相同的操作再循環(huán)一次。3次馴化完成后，移取第3次馴化培養(yǎng)的溶液于無菌管中，梯度稀釋至 10?3、10?4、10?5、10?6后分別吸取 500 μL 涂布到覆有菲膜的MSM瓊脂平板上，在28 ℃條件下避光培養(yǎng)。每日觀察，挑出菌落周圍有透明降解圈的單菌落在含菲膜的MSM瓊脂平板上多次劃線純化，得到的純菌即為菲降解菌（Wang et al.，2016）。采用試管斜面保藏菌種，置于4 ℃下留用。

檢測菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的方式多樣，如血平板法、液滴坍塌法、表面張力法和排油圈法等（Kumar et al.，2016；Xu et al.，2020）。其中，一些菌株本身就含有溶血活性的毒力因子或者產(chǎn)生的生物表面活性劑擴散性差、產(chǎn)量不高從而導致血平板法、液滴坍塌法判斷不準確（Pacwa-Plociniczak et al.，2016）。而排油圈法直觀的反映菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力（畢思寧等，2009），培養(yǎng)液表面張力的降低則能進一步驗證菌株產(chǎn)生生物表面活性劑（Mouafo et al.，2018）。因此，本研究采取排油圈法和表面張力測定法篩選能夠產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株。排油圈法：將50 mL去離子水加入到直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，并滴加1 mL已被蘇丹紅Ⅲ染色的液體石蠟，將20 μL已離心去除菌體的培養(yǎng)液滴加在油膜中心，油膜被向外擠壓從而形成一個圓圈即為排油圈，以不接種菌株的液體培養(yǎng)基為對照（畢思寧等，2009）。表面張力測定法：接種菌株于液體LB培養(yǎng)基中，在28 ℃，130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，然后 10000 r·min?1離心 20 min 去除菌體，用表面張力儀測定去除菌體后培養(yǎng)液的表面張力（Xu et al.，2020）。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)特征

本研究將篩選出來的目標菌株命名為 GHP1，將該菌株單菌落接種于固體 LB平板上培養(yǎng) 72 h（28 ℃），觀察菌落生長形態(tài)特征；與此同時，挑取單菌落接種于液體LB中，并在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌液生長情況。菌體革蘭氏屬性采用革蘭氏染色法并在普通光學顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)使用透射電子顯微鏡觀察。

1.4.2 菌株的生理生化特征

甲基紅反應(yīng)、過氧化氫酶活性、纖維素水解、淀粉水解等生理生化指標參考相關(guān)文獻（東秀珠等，2001）進行測定，運動性采用標準檢測方法驗證（Rashid et al.，2000），菌體表面的疏水性用菌體與水之間的接觸角（θw）來表征（顧海萍，2016），V-P反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生、明膠水解、檸檬酸利用、β-半乳糖苷酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、色氨酸脫氨酶活性通過API20E分析，由北京麥克羅科技有限公司完成。

1.4.3 16S rDNA序列鑒定

用DNA抽提試劑盒提取GHP1菌株的DNA，選用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行 PCR 擴增（石金禮等，2016），PCR產(chǎn)物進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證后交由派森諾基因生物技術(shù)有限公司進行測序。將獲得的序列結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行 BLAST比對，采用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過Neighborjioning方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap進行1000次重復檢驗（Deng et al.，2020）。

1.5 菌株對菲的降解

接種GHP1菌株于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 24 h，離心（8000 r·min?1，4 ℃）5 min后倒掉上清液，收集的菌體用液體MSM洗滌兩次并重新懸浮，然后采用紫外分光光度計調(diào)節(jié)菌懸液的OD600nm值為1.0，待用。

在滅菌棕色玻璃管中加入適量的菲母液，待丙酮揮發(fā)完全，加入9 mL滅菌的液體MSM和1 mL已制備好的菌懸液，使體系中菲的理論初始濃度為100 mg·L?1。將棕色玻璃瓶在 28 ℃、130 r·min?1下培養(yǎng)，每48 h在超凈工作臺中曝氣1 min。分別在0、12、24、48、72 h取樣，根據(jù)Wang et al.（2016）研究中的方法提取、測定體系中菲的殘余量。以未接菌的含菲液體MSM為對照，每個時間點設(shè)置3個重復。

采用一級動力學方程 C=C0×e?kt擬合菲的降解數(shù)據(jù)。其中，t1/2為菲的半衰期，即菲濃度降到50%所耗費的時間t1/2=ln(2)/k，C0是菲的初始質(zhì)量濃度，C是溶液中菲在培養(yǎng)t時間時的殘留質(zhì)量濃度，k是一級動力學常數(shù)（Gu et al.，2021）。

1.6 生物表面活性劑的提取及鑒定

1.6.1 生物表面活性劑的提取及純化

接種菌株GHP1于液體LB培養(yǎng)基中，在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，離心（4 ℃，10000 r·min?1，20 min）獲得無細胞的上清液，然后用 6 mol·L?1鹽酸將上清液酸化至 pH 2.0，并在 4 ℃下儲存過夜。再次在相同條件下離心收集沉淀物，該沉淀物即為生物表面活性劑的粗產(chǎn)物（Xia et al.，2014）。基于 Batool et al.（2017）和 He et al.（2017）的方法提純生物表面活性劑，將粗品溶于氯仿/甲醇（V∶V=2∶1）溶劑中，使得粗品與溶劑的比為 1∶30，超聲30 min后攪拌并過濾，棄掉過濾的殘渣，溶液經(jīng)氮吹后再冷凍干燥，即得純品。

1.6.2 薄層層析

將0.01 g提取的生物表面活性劑溶解在1 mL的氯仿/甲醇（V∶V=8∶2）中，超聲10 min至完全溶解，點樣于硅膠60板（GF254）上進行薄層層析，用氯仿/甲醇/水（V∶V∶V=4∶3∶2）作為流動相展層（馬斌斌等，2017），展層完成后進行顯色反應(yīng)。本研究使用的顯色劑為茚三酮試劑，由溶解在100 mL正丁醇中的1.5 g茚三酮和3.0 mL乙酸組成（Xu et al.，2020）。

1.6.3 傅里葉變換紅外光譜

取約 1.0 mg研磨過的冷凍干燥后的生物表面活性劑粉末與100 mg干燥的KBr粉末研磨均勻，用壓片機壓成幾乎呈透明狀原片后于 4000—500 cm?1光區(qū)進行紅外光譜掃描（Habib et al.，2020）。

1.7 不同培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)生生物表面活性劑能力的影響

測定在不同培養(yǎng)時間、溫度、pH、碳源條件下菌株培養(yǎng)液乳化指數(shù)（E24）的大小，以探究不同培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)生表面活性劑能力的影響。所有實驗均在50 mL的錐形瓶中進行，液體培養(yǎng)基為20 mL，各處理設(shè)置3組重復。E24參照Sun et al.（2019）的方法進行測定，即取已去除菌體的菌株培養(yǎng)液和液體石蠟各5 mL分別加入尖頭離心管中，漩渦震蕩2 min混合均勻，室溫靜置24 h后測量其乳化層高度，并按照下式計算E24：

式中：

he——乳化層高度（cm）；

h——液體總高度（cm）。

1.7.1 培養(yǎng)時間

將制備好的菌懸液按 1∶9（V∶V）接種以蔗糖（質(zhì)量分數(shù)為1%）為唯一碳源的液體MSM，pH為6.5，在28 ℃、130 r·min?1條件下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的24、72、120、168 h取樣，測定菌株培養(yǎng)液的E24。

1.7.2 溫度

將制備好的菌懸液按 1∶9（V∶V）接種以蔗糖（質(zhì)量分數(shù)為1%）為唯一碳源的液體MSM，pH為6.5，分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為 20、28、37 ℃，在 130 r·min?1條件下培養(yǎng)72 h，取樣測定菌株培養(yǎng)液的E24。

1.7.3 pH

將制備好的菌懸液按1∶9（V∶V）接種以蔗糖（質(zhì)量分數(shù)為1%）為唯一碳源的液體MSM，分別設(shè)置培養(yǎng)基的初始pH為5.0、6.5、8.0、9.0、10.0，在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，取樣測定菌株培養(yǎng)液的E24。

1.7.4 碳源

在pH為6.5的液體MSM培養(yǎng)基中加入8種碳源，其中蔗糖、玉米淀粉、柴油、菜籽油、潤滑油、石蠟、甘油按照質(zhì)量分數(shù)為1%添加；菲的添加量為100 mg·L?1（預(yù)實驗表明GHP1菌株在此濃度下生長最佳）。然后按1∶9（V∶V）接種制備好的菌懸液，在 28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，取樣測定菌株培養(yǎng)液的E24。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菲和產(chǎn)生生物表面活性劑菌株的篩選

在涂滿菲的MSM平板上，如果菌落周圍的菲膜消失不見并出現(xiàn)肉眼清晰可見的透明圈，說明污染物菲被菌株降解，此透明圈即為透明降解圈（羅小艷，2015）。透明降解圈反映了菌株具有利用菲的能力，常作為初步篩選菲降解菌的快速方法（Wang et al.，2016）。微生物對于污染物的降解需要一定的適應(yīng)期，產(chǎn)生透明降解圈的速度越快，說明菌株對污染物的適應(yīng)能力越強，降解速度越快（羅小艷，2015）。在初步篩選階段，涂布到覆著菲膜的MSM平板上的菌懸液培養(yǎng)一周后出現(xiàn)清晰可見且形態(tài)不一的單菌落，挑取周圍有透明降解圈的單菌落轉(zhuǎn)接到新的覆有菲膜的MSM平板上，多次進行分離純化，最后純化出8株細菌。其中，GHP1菌株產(chǎn)生透明降解圈（圖1）的速度最快，培養(yǎng)72 h即可將平板上的菲（0.4 mg）利用完全，這說明GHP1菌株能降解污染物菲，且降解能力突出。

圖1 GHP1菌落在覆有菲的MSM平板上產(chǎn)生的透明降解圈

產(chǎn)生排油圈說明菌株產(chǎn)生生物表面活性劑，排油圈的直徑與表面活性劑含量成正比（Hentati et al.，2021）。為確定GHP1菌株是否產(chǎn)生生物表面活性劑，本實驗對去除GHP1菌體后的培養(yǎng)液進行排油圈實驗，并以滅菌的液體LB培養(yǎng)基作為空白對照。結(jié)果顯示，相對于液體LB，去除GHP1菌體后的培養(yǎng)液排油圈清晰可見（圖2），這說明GHP1菌株能產(chǎn)生生物表面活性劑。

圖2 液體LB培養(yǎng)基（A）、菌株GHP1培養(yǎng)液（B）的排油圈Fig. 2 Oil displacement circle of liquid LB medium (A) and strain GHP1 culture solution (B)

表面活性劑是一種能降低表面張力的物質(zhì)（Mouafo et al.，2018）。據(jù)此，通過檢測菌株培養(yǎng)液的表面張力能篩選產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株。在表面張力實驗中，GHP1菌株在液體LB中培養(yǎng)72 h的培養(yǎng)液表面張力為53 mN·m?1，比對照液體LB的表面張力（74 mN·m?1）降低了28.38%，該結(jié)果進一步驗證了GHP1菌株能產(chǎn)生生物表面活性劑這一結(jié)論。

綜上所述，GHP1菌株能夠降解菲且能產(chǎn)生生物表面活性劑，因此選取該菌株作為供試菌株進一步研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

GHP1菌株在液體 LB培養(yǎng)基中 28 ℃、130 r·min?1條件下振蕩培養(yǎng)逐漸變渾濁，30 h后呈現(xiàn)菌團聚物（圖3A）。菌株在固體LB上生長迅速，長勢良好，48 h便可形成清晰可見的菌落，菌落呈黃色，不透明，表面狀態(tài)光滑有光澤，菌落隆起，邊緣結(jié)構(gòu)整齊，質(zhì)地粘稠（圖 3B）。GHP1菌株革蘭氏染色顯示為紅色，表明其為革蘭氏陰性菌（圖3C）。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，GHP1菌體為桿狀，無芽孢，有單端鞭毛（圖3D），可能為運動型細菌（Bruzaud et al.，2015）。污染物的降解取決于降解微生物與污染物之間的有效接觸（Semple et al.，2003），鞭毛則可增加菌株對高疏水性物質(zhì)表面的粘附（Bruzaud et al.，2015）。Gu et al.（2017）的研究表明，有單端鞭毛的運動型PAHs降解細菌能夠增加其與PAHs的接觸機會，提高PAHs的生物可利用性，從而增強PAHs的降解能力。本實驗中，GHP1菌株具有單端鞭毛的特性有利于其對 PAHs的降解。

圖3 GHP1在液體（A）、固體（B）LB培養(yǎng)基中的菌體形態(tài)和光學顯微鏡下的革蘭氏染色（C）以及透射電子顯微鏡下的細胞形態(tài)（D）Fig. 3 Morphology of strain GHP1 in liquid (A), solid (B) LB medium, gram staining under light microscope (C)and cell morphology under transmission electron microscope (D)

2.2.2 菌株的生理生化特征

GHP1菌株的生理生化特征測定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，GHP1是一株運動型細菌，這也與之前透射電鏡下該菌株具有單端鞭毛的結(jié)果（圖3D）相吻合。另外，過氧化氫酶實驗反應(yīng)為陽性，說明GHP1菌株含有過氧化氫酶，許多研究指出能產(chǎn)生過氧化氫酶是微生物降解有機污染物的關(guān)鍵（李雪，2018）。此外，該菌株需氧，能水解淀粉；β-半乳糖苷酶實驗反應(yīng)為陽性；V.P.實驗為弱陽性；其他反應(yīng)則為陰性。

表1 GHP1菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain GHP1

根據(jù)GHP1菌株表面與水的接觸角（θw），可判斷該菌株表面呈中度親水性。PAHs是脂溶性有機污染物，若菌體表面高度親水，則不利于微生物對PAHs的攝取和降解（顏湘波等，2014）。本研究中，GHP1屬于中度親水性菌株，對PAHs的攝取和利用阻礙不大。

2.2.3 菌株的分子學鑒定

利用細菌16S rDNA的通用引物對菌株GHP1進行擴增，最終得到1366 bp的基因序列（GenBank登錄號為 MW345956）。將 16S rDNA基因序列在GenBank上進行序列同源性比較，結(jié)果表明菌株GHP1的16S rDNA基因與Sphingobium abikonense MS64的16S rDNA基因相似度高達100%，與Sphingobium lactosutens DS20、Sphingobium abikonense NBRC 16140、Sphingobium soli THG-SQA7、Sphingobium abikonense IAM 12404、Sphingobium amiense NBRC 102518以及Sphingobium amiense Y的16S rDNA基因相似度均在97.81%以上。對其進行發(fā)育樹的構(gòu)建如圖4所示，從結(jié)果可以看出菌株GHP1與菌株Sphingobium abikonense MS64聚于一類，親緣關(guān)系最近。

圖4 基于菌株GHP1與相似菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain GHP1 and related type strains

綜合形態(tài)觀察、生理生化特征和分子學鑒定結(jié)果，GHP1菌株為 Sphingobium abikonense （S.abikonense）。近些年來，從環(huán)境中分離出一些能降解 PAHs的 Sphingobium屬菌株（Prakash et al.，2006；Dong et al.，2014）中并無 Sphingobium abikonense的相關(guān)研究。因此，進一步研究 Sphingobium abikonense GHP1對菲的降解以及產(chǎn)生生物表面活性劑的特性具有非常重要的參考價值。

2.3 菌株對菲的降解

菌株GHP1作用下菲殘余率的動態(tài)變化如圖5所示。菲的殘余率隨培養(yǎng)時間延長而迅速降低，其中，培養(yǎng)24 h菲的殘余率為70.93%，培養(yǎng)結(jié)束時（72 h）菲的殘余率為 13.92%，該變化符合一階動力學模型（R2=0.859），t1/2約為27.12 h，說明菲降解50%所需要的時間是27.12 h（表2）。目前已被報道的菲降解菌株及其菲降解能力如表3所示，從該表可知，不同屬的菌株對菲的降解能力有差異，其中Sphingobium屬菌株的降解能力最強，本文的研究對象GHP1菌株隸屬于該屬。

圖5 GHP1菌株對菲的降解動態(tài)Fig. 5 Degradation dynamics of phenanthrene by strain GHP1

表2 GHP1菌株對菲降解的一級動力學方程及半衰期Table 2 First-order kinetics equations and the corresponding half-life times of phenanthrene biodegradation by strain GHP1

表3 菲降解菌株及其降解率統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of phenanthrene degrading strains and their degradation rates

顏湘波等（2014）認為，疏水性是影響PAHs微生物降解效果的眾多因素之一。環(huán)境中存在一些中度親水的高效PAHs降解細菌，Wang et al.（2016）和本文的研究均證實了此觀點。另外，GHP1菌株具有運動性，能夠增強菲的生物可利用性，從而提高對菲的降解能力。綜上可知，GHP1菌株具有高效的菲降解能力，在菲污染的微生物修復中具有較大的應(yīng)用潛力。

2.4 生物表面活性劑的鑒定

2.4.1 薄層層析

薄層層析是鑒定生物表面活性劑種類的重要方法（馬斌斌等，2017），GHP1菌株所產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)過薄層層析展層，噴灑茚三酮試劑在比移值Rf=0.7處顯示紅色斑點（圖6），這說明該生物表面活性劑是脂肽（Habib et al.，2020）。

圖6 GHP1菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑薄層層析Fig. 6 Thin layer chromatography of biosurfactants produced by strain GHP1

2.4.2 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜能準確鑒定生物表面活性劑的種類（馬斌斌等，2017），GHP1菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)冷凍干燥后進行傅里葉變換紅外光譜分析，結(jié)果如圖7所示。在3296.75 cm?1處有一較寬的峰，說明該物質(zhì)具有 N-H的伸縮振動（馬斌斌等，2017）；在2925.39 cm?1處出現(xiàn)一個尖銳而狹窄的峰，表明該物質(zhì)具有 C-H的伸縮振動（Huang et al.，2020）；在 1657.62 cm?1處出現(xiàn)一個強有力的峰，屬于C=O和C-N的伸縮振動，即酰胺I帶，這證實了生物表面活性劑分子中存在肽基（Habib et al.，2020）；1535.25 cm?1處的峰意味著酰胺II帶的存在，是N-H彎曲和C-N伸縮振動的組合吸收（Kumar et al.，2016）；1226.27 cm?1處的小峰為C-H的伸縮振動（曾超等，2020）；1064.65 cm?1處的小峰為C-O-C的伸縮振動（Padmavathi et al.，2014）。該結(jié)果進一步驗證了GHP1菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑為脂肽類物質(zhì)，親水基為肽鏈。

圖7 GHP1菌株產(chǎn)生的表面活性劑紅外吸收光譜Fig. 7 Infrared absorption spectra of biosurfactants produced by strain GHP1

目前，已報道的能產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株以及產(chǎn)生的生物表面活性劑種類十分豐富。例如：Pseudomonas aeruginosa 147、Enterobacter sp. SF-4、Lactobacillus plantarum G88能產(chǎn)生糖脂類表面活性劑（Batool et al.，2017；Mouafo et al.，2018；石金禮等，2016）；Serratia marcescens ZCF25、Bacillus siamensis ZCST-1、Staphylococcus sp. CO100能產(chǎn)生脂肽類表面活性劑（Huang et al.，2020；Hentati et al.，2021；曾超等，2020）；Candida albicans 39A2、Bacillus cereus CECT 193、Bacillus licheniformis CECT 491能產(chǎn)生脂蛋白表面活性劑（Haba et al.，2000）；Rhodococcus sp. 135、Pseudomonas sp. 25A3能產(chǎn)生脂肪酸類表面活性劑（Haba et al.，2000）；Klebsiella pneumoniae H1、Bacillus sphaericus EN3、Bacillus azotoformans EN16能產(chǎn)生磷脂類表面活性劑（Adamu et al.，2015；黃楊等，2015）；Candida antarctica T-34、Acinetobacter radioresistens KA53能產(chǎn)生聚合物表面活性劑（Kitamoto et al.，1990；Navon-Venezia et al.，1995）。但是尚未發(fā)現(xiàn)S. abikonense能夠產(chǎn)生生物表面活性劑的研究，這是首次關(guān)于S. abikonense產(chǎn)生脂肽類表面活性劑的報道。

2.5 不同的培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的影響

生物表面活性劑作為細菌的一種次生代謝產(chǎn)物，其合成和分泌受環(huán)境條件影響較大（黃楊等，2015）。乳化指數(shù)（E24）與表面活性劑的濃度成正比，可采用 E24來表征菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力（Habib et al.，2020）。因此，有必要探討環(huán)境因子對GHP1菌株培養(yǎng)液E24的影響。

培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的影響如圖8A所示，隨著培養(yǎng)時間的延長菌株培養(yǎng)液E24分布在51.59%—59.11%之間，呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢。其中，培養(yǎng)72 h菌株培養(yǎng)液的E24最高，與120 h的E24（P=0.065）無顯著性差異，但顯著高于168 h的E24（P=0.013）。這與已有的一些研究結(jié)果類似，Kumar et al.（2016）研究表明 Bacillus licheniformis在96 h的E24達到最大，繼續(xù)培養(yǎng)至120 h菌株培養(yǎng)液的E24下降；Hentati et al.（2021）發(fā)現(xiàn)Staphylococcus sp. CO100菌株培養(yǎng)192 h后，生物表面活性劑的產(chǎn)量下降。這可能是因為培養(yǎng)基中碳源減少，微生物利用生物表面活性劑作為細胞存活的底物導致的（Patowary et al.，2017）。

溫度影響細菌體內(nèi)酶的分泌和活性進而影響微生物生長及其生物表面活性劑的合成（Habib et al.，2020）。根據(jù)圖8B可知，不同溫度培養(yǎng)下菌株培養(yǎng)液的E24在51.70%—59.11%之間，在28 ℃條件下菌株培養(yǎng)液的 E24（59.11%）顯著高于 20 ℃（P=0.010）和 37 ℃（P=0.020）時的 E24，這說明28 ℃為 GHP1菌株的最佳生長溫度，該菌在此溫度下生長代謝速度最快，產(chǎn)生生物表面活性劑最多。同時也表明，GHP1菌株在20—37 ℃范圍內(nèi)均能生長良好并且產(chǎn)生生物表面活性劑。

pH與菌株產(chǎn)生生物表面活性劑密切相關(guān)（Parthipan et al.，2017）。根據(jù)圖8C可知，不同pH條件下菌株培養(yǎng)液的E24在52.95%—59.11%之間，pH 6.5和pH 8.0條件下菌株培養(yǎng)液的E24（P=0.368）無顯著性差異，pH 6.5條件下菌株培養(yǎng)液的 E24（59.11%）顯著高于pH 5.0、9.0、10.0（P值分別為0.001、0.001、0.001）的E24，pH 8.0條件下菌株培養(yǎng)液的 E24（57.17%）顯著高于 pH 5.0、9.0、10.0（P值分別為0.013、0.016、0.009）的E24。由此可見，菌株產(chǎn)生生物表面活性劑受 pH影響較大，GHP1菌株在pH為6.5—8.0條件下產(chǎn)生生物表面活性劑的能力最強，可能與該pH范圍更有利于生物表面活性劑的合成有關(guān)（石金禮等，2016）。其他菌株也有類似的結(jié)果，Achromobacter sp. A-8和Bacillus subtilis A1菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的最適pH 都為 7.0（Parthipan et al.，2017；Deng et al.，2020）。

碳源提供細菌細胞生長、代謝所需要的能量，是維持細菌生長和產(chǎn)生生物表面活性劑的基礎(chǔ)。碳源及其溶解度影響生物表面活性劑的產(chǎn)生（Khajavi-Shojaei et al.，2020）。從圖 8D 可知，GHP1菌株可以分別利用蔗糖、菲、玉米淀粉、柴油、菜籽油、潤滑油、石蠟、甘油8種碳源生長并產(chǎn)生生物表面活性劑，其中，蔗糖和玉米淀粉屬于糖類；柴油、菜籽油、潤滑油、石蠟和甘油屬于油烴類；菲是PAHs的一種。GHP1菌株在不同的底物體系中培養(yǎng)液的E24不同，這是由菌體內(nèi)的酶系決定的（Mouafo et al.，2018）。以蔗糖為唯一碳源時，菌株培養(yǎng)液的E24最大（59.11%），顯著高于其他碳源培養(yǎng)液的E24（P=0.000）；以菲為唯一碳源時，E24最低（48.10%）；其他6種碳源分別添加的情況下，菌株培養(yǎng)液的E24均在52.00%左右。由上述結(jié)果可知，在糖、油烴、PAH三類碳源中，GHP1菌株在以糖為碳源時更易產(chǎn)生表面活性劑。已有研究表明，一部分菌以疏水性底物為碳源更易分泌表面活性劑，如Deng et al.（2020）研究的Bacteria Achromobacter sp. A-8在以食用油和石蠟為碳源時產(chǎn)生表面活性劑的能力最強；另一部分菌以水溶性底物為碳源更易分泌表面活性劑，如Parthipan et al.（2017）研究的 Bacillus subtilis A1在以蔗糖為碳源時產(chǎn)生表面活性劑的能力最強。GHP1菌株在以蔗糖為碳源時培養(yǎng)液的E24最高，可能是因為該菌株體內(nèi)分解蔗糖的酶占主導地位。

圖8 不同培養(yǎng)條件對培養(yǎng)液乳化性指數(shù)（E24）的影響Fig. 8 The effects of different culture conditions on emulsification index (E24) of culture medium

綜上所述，72 h、28 ℃、pH 6.5、蔗糖為碳源是 GHP1菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的最適生長條件，此時的E24為59.11%。GHP1菌株是從多年垃圾焚燒場地土壤中篩選出來的土著菌，在以各種類型的底物為碳源的培養(yǎng)基中都能生長良好且產(chǎn)生生物表面活性劑（圖8），這說明該菌株對底物的接受范圍寬廣，菌株體內(nèi)酶系豐富，能吸收利用各種碳源。Basta et al.（2005）曾報道，Sphingomonad科菌株能夠利用多種類型的底物，適應(yīng)貧營養(yǎng)環(huán)境。本實驗的研究對象——S. abikonense GHP1隸屬于該科，該菌株對環(huán)境的適應(yīng)能力強，易存活，在實際應(yīng)用中具有強大的競爭力和明顯的優(yōu)越性。

3 結(jié)論與展望

本文從多年垃圾焚燒場地的土壤中篩選出一株菲高效降解細菌Sphingobium abikonense GHP1，該菌株能產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，且在以蔗糖為唯一碳源、28 ℃、pH 6.5、培養(yǎng)72 h時其培養(yǎng)液的乳化指數(shù)最高。這是首次關(guān)于 Sphingobium abikonense菌株兼有降解菲和產(chǎn)生生物表面活性劑特性的報道。研究結(jié)果為環(huán)境中PAHs的污染修復和生物表面活性劑的生產(chǎn)提供新的菌源。

本研究探討了菌株GHP1在實驗室環(huán)境下對菲的降解以及產(chǎn)生生物表面活性劑的情況。在自然環(huán)境條件下，影響PAHs污染微生物修復效果的因素非常復雜，菌株適應(yīng)外界環(huán)境條件、成功定殖并成為優(yōu)勢菌種是PAHs降解的關(guān)鍵。采用包埋、制成菌劑、附著可降解載體等手段增強菌株GHP1的環(huán)境適應(yīng)性及競爭力并將其應(yīng)用于PAHs實際污染的修復還有待進一步探究。