生活污水處理中微藻的優選及氮、磷轉化研究

張萍，方淳，朱思涵，韓松，李凱，王志康

貴州民族大學生態環境工程學院，貴州 貴陽 550025

微藻是一類光能自養型生物，沒有真正根、莖、葉的分化，以單細胞的孢子或合子進行繁殖（胡鴻鈞等，2006）。其對環境要求低，生長繁殖快，光合效率高，培養不占耕地（徐凱，2015）。此外，微藻含有豐富的多糖、蛋白質、脂質、蝦青素、卡拉膠等物質（江紅霞等，2003），在水產養殖、生物能源、食品和醫藥等領域有廣泛的應用前景（劉偉，2006）。然而，微藻在生物能源、食品和醫藥等領域的應用成本高（于殿江等，2021），這在一定程度上阻礙了微藻產業的發展。為了降低成本，有研究者提出利用污水養殖微藻。胡洪營等（2009）提出了“污水處理與微藻生物能源生產耦合工藝”，此工藝可凈化污水并同時獲得高價值藻細胞生物質。Prandini et al.（2016）對養豬廢水結合沼氣凈化培養微藻進行研究，發現微生物廢水處理與沼氣相結合不僅能夠加速污染物的去除，同時可促進生物質和生物甲烷的生產。Lu et al.（2015）通過研究小球藻處理肉類加工廢水，發現小球藻在混合廢水中生長的生物量提高，同時藻細胞蛋白質的合成也得到了促進，遠高于傳統來源蛋白質。這表明，混合廢水可平衡營養物質，提高生物量產量和蛋白質含量。生活污水是指人們日常生活中排出的廢水，其富含有機物、氨氮、尿素、磷酸鹽等營養物質，尤其適合用于微藻的養殖（Feffer et al.，2009；李揚，2020）。

隨著經濟的快速發展，城鎮化水平不斷提高，中國生活污水排放量增加（Chai et al.，2021）。傳統市政污水處理多采用兩個獨立的工藝去除氮、磷（Beuckels et al.，2015），氮、磷排放經常超標（黃添浩等，2019），水體富營養化程度加?。↙iang et al.，2013；秦樂樂等，2020）。然而，微藻在生長過程中能吸收污水中的氮、磷營養鹽，在污水氮、磷的去除方面有極大優勢（Olguín et al.，2003；órpez et al.，2008）。同時，某些微藻在特定的培養條件下能選擇性地積累蛋白質、油脂等高附加值產品，利用前景廣闊（郝曉地等，2020）。基于微藻處理污水，不僅可以實現污水的無害化處理，還考慮了污水的資源化屬性，利用污水中的營養元素生產微藻的高價值產品，受到越來越多的關注。

楊福利等（2014）用養殖污水培養小球藻，發現小球藻對污水中氨氮和磷酸鹽去除率達 90%以上。Franchino et al.（2013）將3種微藻置于不同稀釋度消化液中培養，發現 3種微藻幾乎完全去除稀釋污水中的氮和磷，但營養物質濃度過高的農業污水會抑制微藻生長。不同微藻對污水耐受性存在差異，因此，尋找合適的微藻和適宜微藻生長的污水濃度是大規模培養的關鍵。另有文獻報道微藻對污水中不同形態氮、磷的去除具有選擇性（劉淑坡等，2012；黃靜依等，2020）。然而，目前對于不同微藻處理污水過程中涉及的氮、磷形態轉化研究有限。

本文在實驗室條件下選用斜生柵藻（S.obliquus）、普通小球藻（C. vulgaris）和螺旋藻（Spirulina sp.）3種常用微藻作為研究對象，通過序批式實驗，考察微藻在不同濃度模擬生活污水中的生長情況，以及對污水中氮、磷等營養物質的去除情況，探究不同形態氮、磷的變化，旨在明晰微藻去除氮、磷的機理，為處理生活污水提供理論基礎。綜合考慮微藻生長和對污水中氮、磷去除情況，篩選出處理模擬生活污水的合適微藻，為后續探究菌藻共生去除污水中營養物質提供實驗依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材與儀器

（1）試劑和耗材：K2HPO4·3H2O，C6H12O6，MgSO4·7H2O，EDTA-Na2，CuSO4·5H2O，ZnSO4·7H2O均購自成都金山化學試劑有限公司；CaCl2·2H2O，Na2MoO4·2H2O 購自天津市科密歐化學試劑有限公司；C6H8FeNO7，MnCl2·4H2O均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Co(NO3)2·6H2O 購置于廣東光華科技股份有限公司；NH4Cl，H3BO3均購置于天津市永大化學試劑有限公司；本研究所用試劑均為分析純。玻璃纖維濾膜（0.45 μm）為 Whatman公司生產。

（2）主要儀器：UT383迷你照度計（中國優利德），GT10-1型高速臺式離心機（北京時代），SHB-Ⅳ雙循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿），PHB-4型便攜式pH計（上海儀電），JPB-607A便攜式溶解氧測定儀（上海儀電），YXQ-SG46-280S型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊），Alpha-1900S型紫外-可見分光光度計（上海譜元），UB203i型正置生物顯微鏡（重慶澳浦光電），玻璃砂芯漏斗（天津津騰），UPC-I-10T型優普系列超純水器。

1.2 藻種來源與預培養

實驗中所用藻種斜生柵藻（S. obliquus）、普通小球藻（C. vulgaris）和螺旋藻（Spirulina sp.）均購自中國科學院淡水藻種庫。3種微藻均采用滅菌BG11培養基（Malihe et al.，2021）于光照培養箱中培養，培養條件為溫度 25 ℃，光照強度 2000 lux，光暗比12 h∶12 h。采用無菌空氣通氣擴培1周左右，取一定體積的擴培藻液以4500 r·min?1的速度離心5 min，棄上清液后加少量培養基懸浮微藻，即可用于實驗。

1.3 實驗用模擬生活污水

配制低、中、高3種濃度梯度的模擬生活污水用于后續實驗。低濃度生活污水中COD、氮、磷質量濃度分別為 100、15、2.5 mg·L?1；中濃度生活污水中 COD、氮、磷質量濃度分別為 250、30、7.5 mg·L?1；高濃度生活污水中COD、氮、磷質量濃度分別為 500、60、15 mg·L?1。3 種濃度模擬生活污水的成分及含量見表1。

表1 模擬生活污水的成分Table 1 Simulated domestic sewage composition

1.4 實驗設計

本實驗采用1 L三角瓶進行微藻的序批培養，接種的3種微藻初始OD680值為0.100，實驗條件與藻種預培養一致，每天手動搖瓶3次。09:00取樣測水樣中微藻生物量、溶解氧（DO）、pH值和N、P（營養鹽）濃度。

1.4.1 微藻生物量測定

每天取樣監測微藻生物量。螺旋藻呈絲狀，為保證相同的微藻初始生物量，本文采用光密度法測定污水中微藻生物量，即紫外-可見分光光度計在680 nm處的吸光度值OD680（Santos-Ballardo et al.，2015）。為了能準確反映細胞生物量變化，利用顯微鏡血球計數板對斜生柵藻和普通小球藻進行計數。

1.4.2 水質指標測定

實驗期間每天取 10 mL模擬生活污水進行實驗，連續取樣9天，在取樣期間持續進行補水。測定的理化性質包括DO、pH、總磷（TP）、總氮（TN）、胞內總氮（TCN）、胞內總磷（TCP）、溶解性活性磷（SRP）、溶解性總磷（DTP）、溶解性總氮（DTN）、NH4+-N、NO3?-N、NO2?-N。其中，前4項水質指標直接取原水樣測量；其余指標的測定水樣均經 0.45 μm玻璃纖維濾膜抽濾處理，濾膜消解抽濾后的濾液用于測 TCP、TCN。所有指標的測定均參照《水和廢水監測分析方法》（國家環境保護局，1997）。

1.5 數據處理與分析

N、P相關質量濃度計算為式 (1)—(5)，DIN為溶解性無機氮，DON為溶解性有機氮，DOP為溶解性有機磷，其中，NO2?-N 質量濃度很低，忽略不計。去除率（removal efficiency，簡稱R）為經過微藻處理后，污水氮（磷）質量濃度減少量與初始污水質量濃度的百分比，ρ0為初始質量濃度（mg·L?1），ρt為最終質量濃度（mg·L?1）。利用 Origin 2018對數據進行分析與作圖。

2 結果與討論

2.1 微藻的生物量變化

圖1為不同質量濃度模擬生活污水中微藻的生長曲線。0—2天為適應期，3種微藻細胞密度增加較慢；2天后，微藻開始進入對數生長期，斜生柵藻和普通小球藻細胞密度明顯高于螺旋藻，分析原因是微藻生長對污水中營養鹽吸收利用、適應能力有差異，這與趙秀俠等（2018）研究的結果一致。對數生長期后，微藻細胞密度下降或基本不變，而藻液OD680卻在持續增加。梁芳等（2014）通過研究微藻在不同培養時期的藻液吸收光譜，發現OD680值只有在藻細胞穩定期之前才與細胞密度成正比，因此，對數生長期后如果利用OD680值的變化表示細胞密度變化就會產生很大誤差。所以，對數生長期后需要結合藻細胞計數（圖1b 和圖1d）進一步反映微藻生物量情況。

圖1 不同質量濃度模擬生活污水中微藻生物量隨時間變化Fig. 1 Changes of microalgae biomass in simulated domestic sewage with different mass concentrations over time

3—4天為對數生長后期及穩定前期，對比同一種微藻的生物量，發現中、高濃度模擬生活污水中的微藻生物量高于低濃度模擬生活污水中的微藻生物量，這與周海東（2020）得出的較高濃度污水能促進微藻生物量增加結論一致；而對比同一濃度模擬生活污水中微藻的生物量，會發現普通小球藻生物量累積最高，其次是斜生柵藻和螺旋藻，這與鄧祥元等（2013）的研究結果相近。

3種微藻在不同質量濃度模擬生活污水中生長情況如圖2所示。斜生柵藻在3種濃度模擬生活污水中均能較好地生長。普通小球藻在低濃度污水中也呈現較好的生長狀態，但自第5天，由普通小球藻處理的中、高濃度污水顏色由淺綠色變成黃色，最后發白，說明普通小球藻在氮磷質量濃度過高的污水中耐受性較差、生長周期短，對數生長期后便出現衰亡現象（圖2f）。螺旋藻在 3種濃度污水中均無法正常生長，推測導致螺旋藻衰亡的原因是模擬生活污水偏酸性。研究表明，用氨氮作為氮源培養螺旋藻是可行的，但利用氨氮作為氮源值得注意的一點是，螺旋藻適宜在堿性環境下培養（韓佩，2018）。此外，鏡檢觀察到螺旋藻初期為深綠色，藻絲體上藻細胞連接緊密（圖 2g）；對數生長期藻絲體上出現明顯斷裂點，成熟藻絲體周圍有剛脫離的新生藻絲（圖 2h），之后藻絲體顏色變淺、松弛現象明顯，老化藻絲（圖2i）增多。

圖2 低、中、高質量濃度模擬生活污水中各微藻生長情況Fig. 2 Growth of various microalgae in low, medium and high mass concentration simulated domestic sewage

低濃度模擬生活污水中，斜生柵藻和普通小球藻均能較好地生長，且普通小球藻生物量高于斜生柵藻；中、高濃度模擬生活污水中，斜生柵藻生長較好但普通小球藻生長狀態較差，后期死亡，螺旋藻在低、中、高濃度的模擬生活污水中，后期均出現死亡現象。

2.2 模擬生活污水pH變化

各實驗組pH變化如圖3所示。第1—2天，pH均略微降低，但并不顯著，由微藻生長曲線可知，微藻處于生長適應期，光合作用較弱，微藻呼吸作用導致pH降低。2天后，微藻開始適應污水環境，微藻生物量顯著增加，污水pH急劇下降至4.0左右，這是因為本實驗以氨氮為唯一氮源，微藻細胞吸收氨氮后釋放H+，導致pH下降（Li et al.，2010；Perez-Garcia et al.，2011；羅龍皂等，2019）；實驗后期，水體酸化嚴重，部分污水從深綠色逐漸變為淺綠色甚至白色，這是因為微藻細胞的分解以及微藻衰亡均會導致pH下降（于茜等，2016）。特別地，螺旋藻處理的低濃度生活污水pH值自第5天回升后趨于穩定，且始終高于中、高濃度生活污水的pH，由圖 1、2可知，螺旋藻在低濃度生活污水中最先進入衰亡期，推測pH值回升的主要原因是新生藻絲體的產生。

圖3 各處理組pH變化Fig. 3 Changes of pH in each treatment group

2.3 3種微藻對模擬生活污水中氮、磷的去除

氮、磷是微藻生長的必需營養物質，因此微藻對污水中的氮、磷營養鹽有一定的去除效果。通過污水中 SRP、NH4+-N去除率大小可以表征微藻對氮、磷的吸收與去除效果。微藻去除氮、磷包括兩個方面：直接吸收和間接吸收，藻類通過光合作用可同化污水中大量氮、磷等營養物質，將簡單的無機物合成可供自身生長繁殖的有機物，從而去除污水中的氮、磷營養鹽（Su et al.，2011）。

微藻對磷的去除途徑有生物吸收和化學沉淀（余江等，2019）。由于模擬生活污水pH均低于9.0，并未達到9—11的堿性環境，且所配污水未添加鈣、鎂等金屬離子，所以不考慮化學沉淀除磷（黃靜依等，2020）。由表2可知，低濃度模擬生活污水中，3種微藻對SRP去除率均高于50%，尤其是斜生柵藻和普通小球藻表現出較強的除磷能力，SRP去除率分別為82.34%（第6天）和85.67%（第7天）。中、高濃度模擬生活污水中，微藻對SRP亦有一定的去除。自實驗第2天，微藻進入對數生長期，SRP去除率變化明顯，說明微藻對污水中磷的同化作用隨微藻生物量增加而增強。4天后，部分實驗組SRP去除率降低或基本不變，這是由于實驗后期，污水中的磷難以滿足微藻生長需求，部分微藻衰亡又重新釋放磷。王海英等（2011）指出，實驗后期城市污水中TP的去除效果變差，主要是因為污水中磷含量下降，難以維持微藻生長繁殖，與本實驗結果一致。實驗前期，微藻需要吸收磷進行生長繁殖，故對磷需求較高，之后，污水中的磷逐漸被消耗，難以維持微藻的大量繁殖，故對SRP去除速度減緩。此外，在不同生長階段，斜生柵藻對污水中SRP的去除效果均較普通小球藻好。有研究發現，普通小球藻對高濃度污水敏感，受到的抑制作用遠高于斜生柵藻（章斐等，2015）?？梢姡鄙鷸旁迥臀坌愿鼜姟?/p>

表2 3種微藻對不同質量濃度模擬生活污水中SRP的去除率Table 2 Removal efficiency of SRP from simulated domestic sewage with different mass concentrations by three microalgae

微藻吸收污水中無機氮用于有機氮的合成（脫金華等，2019）。模擬生活污水中的NH4Cl是氮的來源，雖藻細胞表面可能會吸附少量氨離子，但這對整體濃度變化并無太大影響。實驗期間，污水處于偏酸性環境中，因此，微藻光合作用引起pH升高促進的氨揮發（Wang et al.，2015；皮永蕊等，2019）并不是除氮的主要方式；此外，模擬生活污水中并不存在氨氧化菌，所以氨氧化也不是脫氮的方式（茍堯，2018）。由此，氨氮去除量主要取決于微藻對氨氮的同化吸收（劉磊等，2014）。

表3中，氨氮去除率出現負值，主要是因為微藻處于適應期，生長受到抑制，其對污水中氨氮吸收較少，中、高濃度污水抑制現象尤為明顯；部分處于成熟期的微藻自身釋放的蛋白質也會增加氨氮含量（于媛等，2006；姜紅鷹等，2017）?？傊?，NH4+-N去除率呈持續增長狀態，說明NH4+-N是微藻易利用的N源（劉磊等，2014）。1—2天，微藻處于適應期，NH4+-N去除效果不明顯；2天后，NH4+-N去除率顯著增加，此時微藻進入對數生長期，可快速利用NH4+-N進行生長繁殖。相較于中、高濃度模擬生活污水，斜生柵藻、普通小球藻和螺旋藻對低濃度模擬生活污水中NH4+-N去除效果較好，最高可達52.16%（第6天）、61.86%（第5天）、36.00%（第6天）。Aslan et al.（2006）研究發現，氨氮濃度小于 22 mg·L?1且磷酸鹽磷濃度小于 7.7 mg·L?1時，氮磷去除率可達最高水平，與本實驗微藻能較好地去除低濃度污水中的氮結論一致。數據表明，普通小球藻對模擬生活污水NH4+-N去除效果普遍優于斜生柵藻和螺旋藻。這是因為普通小球藻對NH4+-N的親和能力更強，對NH4+-N利用率更高（Perez-Garcia et al.，2011）。趙秀俠等（2018）證實了微藻NH4+-N去除效果存在差異，且去除能力從大到小依次為：螺旋藻>小球藻>柵藻。但由于本實驗污水的pH值偏酸性，螺旋藻生長狀況不佳，NH4+-N去除效果不佳。

表3 3種微藻對不同質量濃度模擬生活污水中NH4+-N的去除率Table 3 Removal efficiency of NH4+-N from simulated domestic sewage with different mass concentrations by three microalgae

2.4 污水中的氮、磷形態變化及微藻作用分析

微藻對污水中氮、磷的去除主要是通過微藻的光合作用，將無機氮、磷營養鹽轉化成微藻生物體，所以藻體衰亡會釋放氮、磷元素，這是污水中氮、磷濃度回升的原因（賈緯等，2021）。

NH4+-N是最易被微藻利用的氮形態，如圖 4所示，0—2天，低濃度組斜生柵藻和普通小球藻的TCN質量濃度維持在6.0 mg·L?1和4.0 mg·L?1左右，這與微藻處于適應期有關。斜生柵藻 TCN質量濃度自第3天開始下降，4天后逐漸上升；普通小球藻從第 2天的 4.40 mg·L?1上升至第 5天的 7.89 mg·L?1，后下降至實驗結束時的 5.73 mg·L?1。TCN質量濃度增加是因為微藻生物量的增加，而 TCN的減少與微藻衰亡有關。NH4+-N質量濃度降低到最低水平后又有所回升，這可能與衰亡的微藻細胞分解釋放含氮有機物有關（Ren et al.，2017）。9天后，低濃度模擬生活污水中NH4+-N質量濃度分別降低了 4.49、4.61、1.22 mg·L?1，斜生柵藻和普通小球藻的 TCN 分別增加了 1.0 mg·L?1和 1.6 mg·L?1，螺旋藻因過早衰亡導致 TCN 減少，TCN變化的差異性和微藻種類有關。整體來看，各濃度組NH4+-N的減少主要是因為微藻將NH4+-N同化為有機氮（Chen et al.，2020）。

圖4 低質量濃度模擬生活污水中氮、磷形態變化Fig. 4 Transformation of nitrogen and phosphorus form in low mass concentration simulated domestic sewage

低濃度模擬生活污水中的SRP質量濃度整體呈先下降后上升再穩定的趨勢。1—6天，SRP質量濃度減少，相應的TCP質量濃度逐步增加，特別是對數生長期微藻生物量增加后，SRP質量濃度減少尤為明顯；6天后，污水中SRP質量濃度略微上升后近趨于穩定，原因是微藻的衰亡，這與黃靜依等（2020）的研究一致。DTP質量濃度變化趨勢與SRP一致。普通小球藻（第7天）和螺旋藻（第4天）TCP質量濃度的減少，主要是因為微藻衰亡導致藻細胞內P元素的釋放。DOP由衰亡微藻細胞自融產生（張軍曉等，2017），斜生柵藻處理的低濃度模擬生活污水中 DOP由 0.237 mg·L?1逐漸減小至 0.003 mg·L?1，第3天和第7天DOP下降速度最快，其余時期變化緩慢，說明處于對數生長期、“二次生長”階段的斜生柵藻對磷元素的利用更多，這說明微藻除了能利用污水中的磷源，也能吸收微藻細胞釋放的磷。實驗結束后，斜生柵藻、普通小球藻和螺旋藻 DOP 分別減少 1.104、1.207 和 0.396 mg·L?1，說明低濃度污水中普通小球藻生長狀況較好，其次是斜生柵藻。SRP質量濃度分別減少了1.27、1.39、0.62 mg·L?1；TCP 分別增加了 0.66、0.91、0.59 mg·L?1，表明微藻同化作用將污水中溶解態磷向顆粒態磷轉化，這與黃靜依等（2020）的研究結果一致。

圖5、6分別為中、高濃度模擬生活污水中氮、磷形態變化情況。中濃度組NH4+-N質量濃度分別減少了 15.8、10.9、10.3 mg·L?1，TCN 質量濃度分別增加了 6.0、2.0、4.7 mg·L?1；高濃度組 NH4+-N質量濃度分別減少了 24.1、24.8、24.0 mg·L?1，TCN質量濃度相應增加了 11.4、17.1、6.8 mg·L?1。因此，中、高濃度組微藻吸收轉化的氮較低濃度組多。就氨可利用性而言，微藻從氮、磷濃度較低的培養基進入氮、磷濃度更高的污水中時，可能會導致更大的吸收率（Alejandro et al.，2010）。實驗后期，NH4+-N質量濃度趨于穩定與微藻衰亡有關，可見微藻生長過程中對NH4+-N的消耗有一定的需求，微藻開始衰亡時，NH4+-N并未消耗完全。實驗全過程未檢測到亞硝態氮的存在，表明微藻脫氮是直接吸收NH4+-N，并非通過硝化和反硝化過程完成。

圖5 中質量濃度模擬生活污水中氮、磷形態變化Fig. 5 Transformation of nitrogen and phosphorus form in medium mass concentration simulated domestic sewage

圖6 高質量濃度模擬生活污水中氮、磷形態變化Fig. 6 Transformation of nitrogen and phosphorus form in high mass concentration simulated domestic sewage

中、高濃度組模擬生活污水磷形態變化趨勢與低濃度組基本一致，不同的是，TCP與 DTP所占比例差異較大，這是因為實驗配制的污水濃度不同。中、高濃度組污水磷質量濃度較高，微藻吸收利用的磷會相應增多，過量攝取的磷以聚磷酸鹽顆粒的形式儲存于細胞內（Cuellar-Bermudez et al.，2016）。在接種普通小球藻和螺旋藻的中濃度組模擬生活污水中，DOP分別從第5天、第7天開始持續增加，9天后，DOP分別增加了0.869 mg·L?1和0.349 mg·L?1；高濃度組污水中DOP變化情況與之相似。說明實驗期間較高濃度污水易抑制微藻細胞使其衰亡，不利于微藻的生長（王璐瑤等，2012；常婷等，2019；羅龍皂等，2019）。

3 結論

（1）在研究的3種產業微藻中，斜生柵藻能夠適應較高濃度的生活污水，且適應的濃度范圍最廣；普通小球藻僅能夠在低濃度生活污水中生長，且較斜生柵藻生長快；螺旋藻在3種濃度模擬生活污水中生長狀況均較差，故生活污水不能用于螺旋藻的培養。

（2）3種微藻對低濃度模擬生活污水處理效果最佳，對SRP去除率均高于50%，斜生柵藻和普通小球藻對SRP去除率高達82.34%、85.67%；斜生柵藻、普通小球藻和螺旋藻對NH4+-N去除率分別為 52.16%、61.86%、36.00%，表明，斜生柵藻和普通小球藻能用于生活污水的脫氮除磷。

（3）微藻光合作用是去除污水中可溶性無機氮和可溶性無機磷的主要途徑，通過微藻的光合作用，溶解態氮、磷向顆粒態氮、磷轉化。