NF-κB信號通路調控奶牛乳腺炎的分子作用機制

李宇航，羅仍卓么，王興平*，楊 箭，馬 云, 魏大為

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021； 2.寧夏回族自治區反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021)

乳腺炎是奶牛養殖業中一種發病率極高的疾病，可影響奶牛的健康，給牧場造成巨大的經濟損失[1]。因此，如何降低奶牛乳腺炎的發病率，保證奶牛健康、提高乳品質量和經濟效益的是生產者面臨的問題。為解決上述問題，奶牛乳腺炎抗性分子育種技術亟待研發，而奶牛乳腺炎分子調控網絡解析可為上述問題奠定理論基礎。為探索奶牛乳腺炎發生和發展的分子調控機制，學者們挖掘到了上百個參與調節奶牛乳腺炎的基因或基因位點[2-5]，其中，核轉位因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路是奶牛乳腺炎的主要參與者，可誘導促炎性細胞因子及趨化因子的產生[6]，在乳腺炎癥調節中發揮巨大作用[7-8]。本文綜述了奶牛乳腺炎病因及病理變化，以及多種分子通過NF-κB信號通路調控奶牛乳腺炎的作用機制，以期為相關領域的深入研究提供參考。

1 奶牛乳腺炎病因及病理變化

1.1 奶牛乳腺炎的致病因素

奶牛乳腺炎是由病原微生物、奶牛個體、環境及飼養管理等多種原因引起的復雜疾病。引起奶牛乳腺炎的病原微生物主要有細菌、真菌、支原體和病毒等，其中大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)和乳房鏈球菌(S.uberis)較為常見[9]。以E.coli為代表的革蘭陰性菌可引起臨床乳腺炎，而S.aureus等革蘭陽性菌通常可引起臨床癥狀不太明顯的亞臨床乳腺炎[10]。奶牛個體因素是影響奶牛乳腺炎抗性和易感性的主要因素[11-12]。乳腺炎具有遺傳性，發病率高的母牛其后代發病率也會偏高，另外，高產奶牛易患乳腺炎也同樣具有遺傳性[13-14]。此外，奶牛飼料營養成分、牛舍的溫濕度和糞污污染等環境衛生狀況極大程度地影響著乳腺炎的發生。在現代化牧場中，集約化養殖的擠奶設備也大大增加了乳腺炎的患病率[15]。在上述引發奶牛乳腺炎的多個因素中，個體因素是抗乳腺炎育種的突破口，也是學者們近年來的主要研究熱點，試圖挖掘乳腺炎抗性和易感性相關的基因或基因位點，以期為培育抗乳腺炎奶牛的新品種提供新的分子素材。

1.2 奶牛乳腺炎的病理變化

病原微生物通過乳頭管入侵乳腺組織后，快速增殖，致使乳腺被感染，從而導致乳區血管擴張，血流緩慢，毛細血管通透性增加，局部血流障礙[16]。此外，血液中炎性介質增多，肥大細胞和巨噬細胞產生和分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)和白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等多種促炎細胞因子誘導嗜中性粒細胞從血液進入乳腺組織中，加劇炎癥反應[17]。長期的炎癥反應可使乳腺小葉損傷、炎性細胞浸潤、上皮細胞增生和乳腺淋巴結腫大，嚴重時可導致乳池及輸乳管等組織壞死和萎縮，直至喪失泌乳功能，同時，出現乳汁絮狀沉淀、異味和體細胞數增加[18-20]，致使奶牛產奶量下降、乳品質降低和治療成本增加，以及母牛被過早淘汰，給牧場造成巨大的經濟損失。

2 NF-κB信號通路與機體免疫

NF-κB廣泛存在于各種細胞內，其家族有5個成員，分別為：RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)[21]，它們都包含能結合DNA的Rel同源結構域，通過形成二聚體而正向或負向調控多種功能基因的轉錄[22]，從而參與調節細胞免疫、應激反應、增殖和凋亡等多種生物學過程[23-24]。

NF-κB信號通路由多種蛋白質組成，主要包括二聚體轉錄因子(NF-κB/Rel)、與NF-κB相互作用的NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)和上游的IκB蛋白激酶(I kappa B kinase，IKK)等[25]。NF-κB信號通路是免疫系統正常發育和形成、淋巴器官生成、病原體識別、炎癥、啟動先天免疫反應和適應性免疫反應所必需的[21]。通常NF-κB與相關基因的啟動子結合，進而啟動炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6等)、趨化因子(CXCL-8、CCL2和CCL5等)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等基因的轉錄[26-27]，從而調節人和其他動物的機體免疫以及多種類型的炎癥性疾病[25]。NF-κB的激活通常是源于兩種不同通路之一進行信號轉導的結果，被稱為經典的和非經典的NF-κB信號通路(圖1)[28]，這兩種通路的末端都存在多種類型的NF-κB、IκB和IKK，他們共同構成了NF-κB信號通路的核心[29-30]。眾所周知，先天免疫是抵御病原體入侵的第一道防線，Toll樣受體家族(toll-like receptors，TLRs)是一類可以識別多種微生物成分并誘導先天性免疫反應的主要傳感器[26]。經典的NF-κB信號通路中，病原微生物感染宿主細胞后，受到TLRs、IL-1和TNF-α等刺激，IKK被激活，致使磷酸化IκB降解，從而使p65、p50從細胞質轉移到細胞核，這一過程使NF-κB通路由抑制狀態迅速轉變為活化狀態，從而引起炎癥反應[31]。與經典的NF-κB信號通路相比，非經典通路通常導致更持久的NF-κB活化反應[29]，通過淋巴毒素β受體(recombinant lymphotoxin beta receptor，LTβR)、B細胞激活因子受體(B cell activating factor receptor，BAFF-R)和CD40配體等特異性受體激活，IKKα磷酸化，p100被激活并降解，隨后形成p52/RelB異源二聚體，轉移到細胞核并調節下游靶基因轉錄[32]。

圖1 NF-κB信號通路調節機體免疫Fig.1 NF-κB signaling pathway regulates immunity

3 NF-κB信號通路與奶牛乳腺炎

作為調節炎癥的關鍵信號通路，NF-κB通路在許多炎癥性疾病中扮演著重要的角色。病原體侵染奶牛乳腺組織可激活NF-κB及其信號通路，參與調節乳腺炎癥。近年來，NF-κB信號通路作為奶牛乳腺炎分子治療的重要靶點被廣泛研究，并取得了重要進展。

3.1 奶牛乳腺炎對NF-κB活性的影響

NF-κB有兩種活性形式，一種與IκB結合以非活化的形式存在于細胞質中，另一種是受到刺激后IκB磷酸化發生降解，迅速進入細胞核，以活化的形式結合DNA[33]。與健康奶牛相比，感染乳腺炎的奶牛由于受致病細菌的刺激，NF-κB信號通路被激活，乳腺上皮細胞中NF-κB活性升高(這種活性與IL-8和GM-CSF表達高度相關)，導致相關炎癥蛋白(如黏附分子、趨化因子和細胞因子)的表達水平增加，從而觸發了細胞炎癥反應[6,34-35]。此外，Boulanger等[6]研究發現，在健康奶牛乳體細胞中檢測不到有活性的NF-κB復合物，而在臨床型乳腺炎奶牛乳體細胞中NF-κB的活性很高，在亞臨床型乳腺炎牛乳體細胞中NF-κB的活性略有升高，說明奶牛乳腺炎可增加NF-κB活性。

3.2 NF-κB信號通路在奶牛乳腺炎中的調控作用

NF-κB信號通路的活化與奶牛乳腺炎癥反應密切相關。目前研究發現，多種mRNA、非編碼RNA和生物活性物質均可通過不同方式影響NF-κB活性及其信號通路，進而調節奶牛乳腺炎的發展。

3.2.1 mRNA通過NF-κB通路調節奶牛乳腺炎 奶牛乳腺炎的發生和發展過程受多個機體免疫和炎癥相關的編碼基因共同調節。近年來，學者們就E.coli及S.aureus引起的乳腺炎開展了很多編碼基因調控奶牛乳腺炎的分子機制研究，主要集中在NF-κB相關的信號通路上。

TLRs在識別多種微生物和激活先天免疫系統中起著關鍵作用，越來越多的證據表明，TLRs及其配體在炎癥、腫瘤發生和自身免疫紊亂等多種病理條件下具有重要意義[36]。目前，在牛中已發現10個成員(TLR1～10)[37]，其中，Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)和Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)可識別革蘭陽性菌和革蘭陰性菌表面的病原體相關模式分子，進而激活細胞內NF-κB信號通路[38]。

TLR4途徑介導的NF-κB信號通路也受到其他mRNA的調節。過表達泛素樣修飾劑1連接酶1(ubiquitin-fold modifier1-specific ligase 1，UFL1)可抑制TLR4的表達、IκBα的降解和p65的磷酸化，從而抑制促炎性細胞因子的表達，降低內質網凋亡、自噬和氧化應激，減輕炎癥反應和細胞損傷[39]，說明，UFL1通過調節NF-κB的轉錄活性和靶基因的表達在乳腺炎癥反應中發揮抑制作用。Sirtuin7(SIRT7)是一種NAD+依賴性脫乙酰酶，參與核糖體RNA合成、蛋白質合成、DNA損傷反應、代謝和腫瘤發生等多種生物學過程[40]。Chen等[41]研究發現，SIRT7在患有乳腺炎的奶牛乳腺組織和LPS處理的奶牛乳腺上皮細胞中表達量下調，可減弱TLR4、轉化生長因子活化激酶結合蛋白1(TAK1-binding protein 1，TAB1)和p-TAK1的上調，抑制NF-κB通路活化，從而下調炎性細胞因子、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和NO的表達，進而抑制細胞炎癥及細胞凋亡。

除以上mRNA外，還有一些mRNA可以通過NF-κB通路發揮作用。細胞色素氧化酶P4501A1(cytochromes P4501A1，CYP1A1)基因在乳腺炎奶牛的乳腺組織和炎性上皮細胞(inflammatory epithelial cells，INEs)中的表達均顯著下調[42]。Zhang等[42]研究發現，在LPS誘導的奶牛乳腺炎中超表達CYP1A1基因可促進乳腺上皮細胞增殖，并且通過抑制NF-κB信號通路的激活而抑制TNF-α和IL-6的表達，從而減輕乳腺上皮細胞炎癥反應。脂肪酸結合蛋白3(fatty acid binding proteins 3，FABP3)在奶牛乳腺上皮細胞及外周血白細胞中均高豐度表達，可通過介導過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)的表達來抑制NF-κB通路活化，從而調控LPS誘導的奶牛乳腺炎癥反應[43]。Szperka等[44]發現，牛FLICE樣抑制蛋白(flice-like inhibitory protein，FLIP)的高表達阻斷了LPS和TNF-α誘導的NF-κB依賴性基因產物的上調，表明牛FLIP能夠作為一種抗凋亡信號分子發揮作用，還具有下調NF-κB依賴性基因表達的額外能力。在感染S.aureus的荷斯坦奶牛中，蛋白顆粒復合體9基因(trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)位點對白介素-17(interleukin-17，IL-17)有極顯著正相關效應，并且分析發現，血清IL-17與NF-κB含量呈極顯著正相關，說明TRAPPC9有可能通過IL-17而增強NF-κB信號通路的活化能力，最終影響了奶牛對S.aureus型乳腺炎的抗性[45]。雖然以上mRNA均可通過NF-κB調節奶牛乳腺炎癥，但具體調節機制尚未闡明，仍需要進一步探索。

3.2.2 miRNA通過NF-κB通路調節奶牛乳腺炎 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約20～25個核苷酸所組成的內源性非編碼RNA，可通過與mRNA 3′UTR結合來抑制靶基因的翻譯，從而調節細胞增殖分化、發育、穩態和疾病進展等多種生物學過程[46-47]。Li等[48]研究發現，IKKα是miR-223、miR-15a和miR-16的靶點，在人單核-巨噬細胞分化過程中，上述miRNA的表達下調，使IKKα蛋白顯著增加，從而促進p52的產生，這一途徑是通過抑制NF-κB靶基因來防止新的巨噬細胞過度激活，同時，為新的NF-κB信號通路的激活做好準備。miR-223可能是炎癥的負調節因子，可靶向IKKα和轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)基因，通過NF-κB信號通路調節單核細胞和巨噬細胞分化而調節機體炎癥[48-49]。Li等[50]發現,miR-145可通過抑制二磷酸腺苷核糖基化因子6(adenosine diphosphate ribosylation factor 6,ARF6)的表達阻斷和減少NF-κB信號通路，從而抑制炎癥因子的分泌，起到改善巨噬細胞炎癥狀態的作用。在奶牛乳腺炎中，Chen等[51]研究表明，包括miR-223在內的25個miRNA在乳腺炎奶牛中的表達量顯著下降，而10個與NF-κB信號通路相關的mRNA(RelA,Rel,p105,p100,IκBα,IκBβ,IκBδ,IκBζ,Bcl-3和IKKα)的表達量均顯著增加，推測出這些miRNA 可抑制NF-κB信號通路中的基因表達，以維持奶牛的免疫平衡。上述結果說明，在乳腺炎奶牛中，一些低水平的miRNA降低了對NF-κB信號轉導基因的抑制作用，從而促進免疫相關基因表達，進而參與了抵抗細菌侵襲的免疫應答。

現有報道表明，miR-146a和miR-214通過靶向NF-κB信號通路相關基因調節奶牛乳腺炎癥(圖2)。Wang等[52]研究發現，與健康奶牛相比，感染S.aureus或E.coli型乳腺炎奶牛的乳腺組織中miR-146a的表達量顯著上調，可顯著抑制牛腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor related factor 6，TRAF6)及其下游NF-κB的mRNA 和蛋白表達水平，從而抑制炎癥介質TNF-α、IL-6和IL-8的產生。上述結果證明，miR-146a通過下調TLR4/TRAF6/NF-κB通路發揮炎癥負反饋調節作用。促有絲分裂原蛋白激酶活化激酶14(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 14，MAP3K14)是NF-κB信號通路上腫瘤壞死因子受體相關因子3(tumor necrosis factor receptor related factor 3，TRAF3)的下游基因，TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)是TLR信號通路上TRAF3的下游基因[27,36]。Song等[53]對奶牛乳腺上皮細胞中的miR-214進行干擾或過表達，發現miR-214可通過靶向抑制活化T細胞核因子3(nuclear factor of activated T cells C3，NFATc3)和TRAF3的表達，并間接抑制下游MAP3K14(NF-κB和腫瘤壞死因子信號通路關鍵基因)、TBK1(TLRs信號通路基因)及炎性細胞因子IL-6和IL-1β的表達，從而調節奶牛乳腺炎。此外，miR-155模擬物轉染小鼠乳腺上皮細胞可促進TNF-α和IL-1β的分泌，增強TLR2的表達，并激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號通路相關蛋白質的磷酸化，表明miR-155可促進S.aureus誘導的小鼠乳腺炎癥[54]。然而，miR-155是否參與NF-κB信號通路介導的奶牛乳腺炎癥，至今未見文獻報道，有待進一步研究。

圖2 miRNA通過NF-κB信號通路調節奶牛乳腺炎Fig.2 miRNA regulates bovine mastitis through NF-κB signaling pathway

3.2.3 lncRNA通過NF-κB通路調節奶牛乳腺炎 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。許多功能性lncRNA已被鑒定為各種生理和病理過程中的關鍵調節因子[55-56]，近年來，人類各種疾病的組織中檢測到大量差異表達的lncRNA[57]。越來越多的證據表明，lncRNA在炎癥反應中發揮著重要的作用，成為多種炎癥的生物標志物[58]，但是，lncRNA通過NF-κB信號通路調節奶牛乳腺炎的報道較少。

NF-κB信號通路介導的lncRNA在奶牛乳腺炎中的研究，目前，僅lncRNA XIST、lncRNA LRRC75A-AS1和lncRNA H19有相關研究報道(圖3)。?zdemir和Altun[59]在正常及感染牛分枝桿菌(M.bovis)的奶牛乳腺組織中，發現有1 310個差異表達mRNA和57個差異表達lncRNA(包含19個新的差異表達lncRNA)。M.bovis感染的奶牛乳腺組織通常通過NF-κB通路產生免疫應答，lncRNA-mRNA共表達網絡在NF-κB和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositide 3 kinases/protein kinase B，PI3K-Akt)通路中發揮作用，有助于了解奶牛乳腺組織中M.bovis免疫應答的分子機制[59]。在E.coli或S.aureus誘導的奶牛乳腺炎中，lncRNA XIST可通過抑制NF-κB通路的激活和促炎癥細胞因子的形成，來延緩細胞凋亡、維持細胞活力和促進細胞增殖[60]。活化的NF-κB通路可促進XIST和NOD樣受體蛋白3 (NOD-like receptor protein，NLRP3)炎癥小體的表達，同時，XIST負反饋調節NF-κB/NLRP3炎癥小體通路，從而介導炎癥過程，表明XIST在奶牛乳腺炎中可抑制過度和持續的炎癥過程[60]。Wang等[61]研究發現，lncRNA LRRC75A-AS1通過靶向LRRC75A基因，使緊密連接蛋白表達量增加，調節細胞的通透性，抑制細菌的侵襲及黏附能力，并通過抑制NF-κB信號通路的激活減輕乳腺炎癥反應。在奶牛乳腺炎中，lncRNA H19的過度表達通過促進炎性細胞因子的分泌和NF-κB通路的激活，增強奶牛乳腺上皮細胞系(mammary alveolar cell-T，MAC-T)的免疫應答，在炎癥結束時，lncRNA H19的過度表達上調了緊密連接蛋白，恢復了血乳屏障，有利于被感染乳腺的功能恢復[62]。綜上所述，目前，僅有3個lncRNA在奶牛乳腺炎中開展了調控機制研究。與所篩選的差異表達lncRNA的數量相比，仍有很多差異表達lncRNA在NF-κB信號通路中的調控作用及其在奶牛乳腺炎中的作用機制有待于進一步探索。

圖3 LncRNA通過NF-κB信號通路調節奶牛乳腺炎Fig.3 LncRNA regulates bovine mastitis through NF-κB signaling pathway

3.2.4 circRNA可能通過NF-κB通路調節奶牛乳腺炎 環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類呈封閉環狀的非編碼RNA，結構穩定，不易受RNA外切酶影響，其表達具有組織特異性[63]。CircRNA分子富含miRNA的結合位點，起到miRNA分子海綿的作用，進而間接實現對miRNA靶基因的調節[64]，廣泛參與人體和動物體的多種生理學及病理學的調控過程[65]。

目前為止，circRNA關于對奶牛乳腺炎方面調控的研究僅有極少數文獻報道。王兵兵[66]研究發現，circLPP在奶牛乳腺感染炎癥后的表達水平顯著上調，通過circLPP/miR-615/SPRED3(sprouty related EVH1 domain containing 3)相互調控作用而誘導炎性細胞因子分泌，降低乳腺上皮細胞的活力并抑制其增殖，從而參與乳腺炎發展過程。張彭媛[67]發現，circKIAA在炎癥狀態下的奶牛乳腺組織及LPS誘導的乳腺上皮細胞中表達均明顯高于正常組，circKIAA可通過對miR-326的海綿吸附作用而促進炎性細胞因子和上調B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達，進而抑制乳腺上皮細胞的增殖并誘導其凋亡。值得注意的是，circRNA可通過NF-κB調節人和小鼠的炎癥過程(圖4)。小鼠circ_1639充當miR-122的海綿，靶向調節腫瘤壞死因子受體超家族13C(tumor necrosis factor receptor superfamily 13C，TNFRSF13C)基因，促進NF-κB通路的激活，從而加重酒精性肝炎[68]；circRNA_09505通過miR-6089/AKT1/NF-κB軸加重類風濕關節炎小鼠的炎癥和關節損傷[69]；circ-RELL1通過miR-6873-3p/髓樣分化因子88(MyD88)/NF-κB軸調節人內皮細胞的炎癥反應[70]；circ_0054633通過NF-κB信號通路減輕了LPS誘導的大鼠急性肺損傷[71]。另外，circ-Sirt1可通過與NF-κB p65直接相互作用，進而抑制NF-κB的激活[72]。綜上所述，circRNA可以通過NF-κB信號通路調節人或大鼠、小鼠模型的一些炎癥性疾病。但是，迄今為止，在牛中沒有circRNA通過NF-κB信號通路調節炎癥的研究報道。不同物種基因序列和功能上具有相似性，因此，推測circRNA也有可能通過NF-κB通路而調節奶牛乳腺炎，有待于進一步探索，這也可為學者們的進一步研究提供新思路。

圖4 CircRNA通過NF-κB信號通路調節炎癥Fig.4 CircRNA regulates inflammation through NF-κB signaling pathway

3.2.5 生物活性物質通過NF-κB通路調節奶牛乳腺炎 中草藥在預防及治療疾病中發揮著顯著的作用，其中，許多已被證明對多種疾病有免疫調節、抗炎和抗氧化等生物學功能，并且能對病原菌產生明顯的抑制效果[73-74]。中草藥對疾病的作用主要依賴于其中的生物活性物質[75]。生物活性物質具有種類多、無藥物殘留、不產生耐藥性和刺激較小等優點，在奶牛乳腺炎的治療上有較大的優勢和潛力[76-77]。近年來，學者們進行了多種生物活性物質對奶牛乳腺炎的調控機制研究，發現這些生物活性物質大多都是通過NF-κB信號通路而調節奶牛乳腺炎癥過程(表1)，這些重要進展可為治療奶牛乳腺炎新型藥物和飼料添加劑的研發提供理論參考。

表1 不同生物活性物質通過NF-κB信號通路對奶牛及模式動物乳腺炎的調節作用

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4 展 望

NF-κB作為細胞內重要的轉錄調節因子，已成為奶牛乳腺炎研究的重要靶點，調控NF-κB信號通路是控制奶牛乳腺炎的有效策略。近年來，學者們研究了部分mRNA和非編碼RNA通過NF-κB調節乳房炎的分子作用機制。同時，已發現較多生物活性物質可通過NF-κB通路對乳腺炎產生聯合治療效果。但是，上述研究大部分僅集中在細胞水平上，亟待開展在實驗動物及奶牛活體水平的驗證。此外，非編碼RNA通過NF-κB信號通路對奶牛乳腺炎的調控作用機制研究較少，尤其是circRNA暫未見報道。因此，更多非編碼RNA通過NF-κB通路對奶牛乳腺炎的分子調控機制仍然需要深入研究。探明NF-κB通路的調節機制，可為奶牛乳腺炎的生物治療、乃至生物活性藥物研發與應用奠定基礎，將有助于實現奶牛安全健康養殖和提高牧場經濟效益。