基于RAGE-TLR4串擾的高糖影響牛肺泡巨噬細胞促炎細胞因子釋放的分子機制

譚天宇，才冬杰，茍麗萍，任志華，左之才

(四川農業大學動物醫學院，動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

葡萄糖是細胞重要的能量來源，但現有研究發現高濃度的葡萄糖(以下簡稱高糖)具有促進炎癥反應的作用[1-2]。在牛相關體外研究中已證實高糖能夠促進牛肝細胞釋放促炎細胞因子，從血糖角度解釋了肝炎癥損傷的可能原因[3]。犢牛斷奶、運輸等應激與呼吸道疾病發病率、嚴重程度有關，并且在應激過程中血糖顯著升高[4-5]，血糖升高也被認為是影響牛呼吸道疾病綜合征嚴重程度的標志物之一[6]。肺泡巨噬細胞是調節肺部炎癥反應，維持肺炎癥微環境的免疫細胞[7]，在牛呼吸道疾病的發生發展中發揮重要作用[4]。然而葡萄糖濃度的升高對于牛肺泡巨噬細胞(bovine alveolar macrophages, BAMs)促炎細胞因子釋放的影響及其機制尚不清楚，缺乏相關研究。

目前研究發現，高糖能上調糖基化終末產物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)與Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)，活化下游核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，從而促進促炎細胞因子的合成與釋放[8-9]。當RAGE與TLR4均被激活時會發生受體間串擾，對下游共同的信號通路NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等產生協同激活作用[10-11]。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是TLR4下游MyD88依賴途徑中重要的接頭分子[12]，有研究指出MyD88可能在RAGE信號通路中也發揮接頭分子的作用，傳導來自RAGE的炎癥信號[13]。但RAGE與TLR4能否協同上調MyD88的表達使其進一步激活，尚未有研究證實。另外，受體間串擾也表現受體的功能與表達會互相影響，如抑制TLR4會一定程度抑制小鼠單核巨噬細胞TLR2的功能與表達[14]。但RAGE與TLR4是否通過受體間串擾互相影響對方的表達，尚未有研究報道。綜上所述，本試驗探究高糖能否通過RAGE-TLR4串擾調控BAMs RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB的激活及促炎因子的釋放，并進一步探討RAGE/TLR4的潛在串擾機制，為研究高糖調控BAMs炎癥反應的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

高糖DMEM、低糖DMEM培養基購自索萊寶(中國)；胎牛血清購自生工生物工程有限公司(中國)；PremixTaq酶、反轉錄試劑盒購自寶生物公司(日本)；原代牛肺泡巨噬細胞采自健康牛新鮮肺部組織；β-actin、RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB的實時熒光定量檢測引物見表1,引物由生工生物工程有限公司合成。MyD88抗體(Fitzgerald，貨號70R-50098)、NF-κB p65抗體(CST，貨號C22B4)、RAGE抗體(Abcam，ab37647)、TLR4抗體(Proteintech，貨號19811-1-AP)、β-actin抗體(Abcam，ab8226)以及羊抗兔IgG-HRP(索萊寶，貨號SE134)。IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA檢測試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。

表1 各基因實時熒光定量引物序列

1.2 方法

1.2.1 BAMs的采集與分組處理 參照文獻[15]中原代BAMs采集與鑒定方法，肺泡巨噬細胞陽性率大于96%。采取眼觀健康無病變的新鮮且完整的牛肺，結扎氣管防止污染。用經過高壓滅菌且含有200 IU·mL-1青霉素、200 μg·mL-1鏈霉素的PBS對肺表面進行沖洗，并將PBS經氣管灌入肺部，輕揉牛肺5 min，使用注射器收集灌洗液，重復灌洗3次。收集到的灌洗液經200目尼龍紗布過濾，1 200 r·min-1離心6 min，收集細胞。PBS洗滌細胞，1 200 r·min-1離心6 min，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養液重懸細胞，并進行細胞計數，置于37 ℃二氧化碳恒溫培養箱培養6 h。PBS洗去未貼壁細胞，消化重懸細胞，調整細胞數為1×106個·mL-1，并通過臺盼藍染色法計算細胞存活率，瑞氏染色法進行形態學鑒定，墨汁吞噬試驗計算巨噬細胞陽性率。分裝于細胞培養瓶中，置于培養箱內培養3 h。3 h后將原代BAMs隨機分為正常對照組(NG，5.5 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(HG，25.5 mmol·L-1葡萄糖)、HG+FPS-ZM1(RAGE抑制劑，1 μmol·L-1)組、HG+TAK-242(TLR4抑制劑，10 μmol·L-1)組及DMSO組(DMSO占培養體系0.1%)培養12 h，抑制劑組在高糖處理前需用TAK-242或FPS-ZM1預處理1 h，每組設置3個平行。12 h后離心收集培養后的上清液及下層細胞，上清液用于ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平，下層細胞用于qRT-PCR檢測RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相對表達水平及Western blot檢測RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達水平。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測BAMsRAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65 mRNA相對表達水平 對收集到的BAMs中總RNA采用Trizol法進行提取，并測定總RNA濃度及純度，采用反轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄，得到的cDNA置于-20 ℃保存備用。以cDNA為模板，對每組RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65的mRNA相對表達水平進行檢測。實時熒光定量PCR反應體系：上下游引物各0.5 μL，PremixTaq5.0 μL，cDNA模板4.0 μL，總體系10 μL。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，循環40次，每個循環后檢測熒光強度值Cq。實時定量PCR的結果采用 2-△△Ct法進行計算，用內參基因β-actin對各基因表達水平均一化，2-△△Ct法計算公式: △Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct試驗組-△Ct對照組。

1.2.3 Western blot檢測BAMs RAGE、TLR4、MyD88和NF-κB p65的蛋白相對表達 按每孔細胞加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液，至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃高速離心吸取并上清，采用BCA法對蛋白質定量后于-80 ℃保存待檢。調整每孔上樣蛋白量為15 μg，電泳程序為濃縮膠80 V 20 min，分離膠120 V 60 min。蛋白樣品經電泳分離后，采用半干式轉膜，25 V轉膜30 min。 使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，與MyD88(1∶1 000)、 NF-κB p65(1∶1 000)、RAGE(1∶1 500)、 TLR4(1∶800)以及β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，按照1∶1 000 稀釋HRP標記的二抗，與膜37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，最后采用ECL化學發光檢測。

1.2.4 ELISA檢測BAM上清液中TNF-α，IL-1β，IL-6水平 吸取BAMs細胞培養液，離心收集上清。參照ELISA試劑盒說明書檢測每組上清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結 果

2.1 FPS-ZM1與TAK-242抑制高糖促進的BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達

HG組BAMs的RAGE、TLR4、MyD88以及NF-κB的基因表達水平均極顯著高于NG組(P<0.01)。HG+FPS-ZM1組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表達水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。HG+TAK-242組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表達水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。DMSO組與NG組各基因表達水平均無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

結果表明，高糖能夠引起BAMsRAGE、TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA表達上調，而TLR4抑制劑TAK-242與RAGE抑制劑FPS-ZM1均能抑制高糖引起的RAGE、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達上調。其中，抑制RAGE能夠下調TLR4 mRNA相對表達水平，抑制TLR4能夠下調RAGEmRNA相對表達水平，并且抑制RAGE與TLR4均能下調MyD88與NF-κB p65 mRNA相對表達水平。由此說明，高糖在處理BAMs細胞時在基因水平上產生了RAGE-TLR4串擾，對RAGE、TLR4本身的mRNA轉錄產生影響，并協同促進下游MyD88、NF-κB p65 mRNA轉錄。

與NG組相比，*.P<0.05差異顯著，**.P<0.01差異極顯著；與HG組相比，#.P<0.05差異顯著，##.P<0.01差異極顯著Compared with NG group, *.P<0.05, **.P<0.01; Compared with HG group,#.P<0.05,##.P<0.01圖1 高糖及高糖與不同抑制劑共處理對BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB基因表達的影響Fig.1 Effects of high glucose, high glucose and different inhibitor treatments on BAMs gene expression of RAGE, TLR4, MyD88 and NF-κB

2.2 FPS-ZM1與TAK-242抑制高糖促進的BAMs RAGE/TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表達

HG組BAMs的RAGE、TLR4、MyD88以及NF-κB的蛋白表達水平均極顯著高于NG組(P<0.01)。HG+FPS-ZM1組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。HG+TAK-242組RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平顯著高于NG組(P<0.05)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。DMSO組與NG組各蛋白表達水平均無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

與NG組相比，*.P<0.05差異顯著，**.P<0.01差異極顯著；與HG組相比，#.P<0.05差異顯著，##.P<0.01差異極顯著Compared with NG group, *.P<0.05, **.P<0.01; Compared with HG group,#.P<0.05,##.P<0.01圖2 高糖及高糖與不同抑制劑共處理對BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達的影響Fig.2 Effects of high glucose and different inhibitor treatments on BAMs protein expression of RAGE, TLR4, MyD88 and NF-κB

高糖能夠引起BAMs RAGE、TLR4、MyD88及NF-κB p65 蛋白表達上調，而TLR4抑制劑TAK-242與RAGE抑制劑FPS-ZM1均能顯著抑制高糖引起的TLR4、RAGE、MyD88及NF-κB p65 蛋白表達上調。其中，抑制RAGE能夠下調TLR4 的蛋白表達，抑制TLR4能夠下調RAGE的蛋白表達，并且抑制RAGE與TLR4均能下調MyD88與NF-κB p65蛋白水平。由此說明，高糖在處理BAMs細胞時在蛋白水平上產生了RAGE-TLR4串擾，對RAGE、TLR4本身的蛋白表達產生影響，并協同促進下游MyD88、NF-κB p65 蛋白表達。

2.3 FPS-ZM1與TAK-242抑制高糖促進的BAM促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α釋放

HG組BAMs培養上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白濃度極顯著高于NG組(P<0.01)。HG+FPS-ZM1組IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白濃度均極顯著高于NG組(P<0.01)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。HG+TAK-242組IL-1β、IL-6蛋白濃度顯著高于NG組(P<0.05)，TNF-α濃度極顯著高于NG組(P<0.01)，但均極顯著低于HG組(P<0.01)。DMSO組與NG組各蛋白表達水平均無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

高糖能夠引起BAMs IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白釋放增加，而TLR4抑制劑TAK-242與RAGE抑制劑FPS-ZM1均能顯著抑制高糖引起的IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白釋放。

3 討 論

高糖可促進炎癥反應，引起機體IL-1β、 IL-6及TNF-α等促炎因子釋放[16-17]。高糖相關體外細胞試驗中，25.5 mmol·L-1葡萄糖濃度是對于大部分體外培養細胞的高糖濃度，也是高糖相關研究的常用葡萄糖濃度[18-19]，因此本次研究采用25.5 mmol·L-1葡萄糖濃度作為高糖。在本次試驗中，高糖處理能夠引起BAMs釋放促炎細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，與前人研究結論相符。目前研究認為高糖主要通過TLR4、RAGE等固有免疫受體，激活下游NF-κB促進促炎細胞因子釋放[9, 20]，但受體下游信號途徑的傳導激活有待進一步完善。Zhao等[21]研究發現，高糖能顯著上調視網膜神經細胞TLR4/NF-κB的mRNA和蛋白表達，并促進促炎細胞因子TNF-α的分泌，而抑制TLR4能顯著抑制NF-κB mRNA、蛋白表達以及TNF-α的分泌，表明高糖能通過TLR4激活NF-κB， 促進細胞分泌促炎因子TNF-α。詹聃婷等[22]研究發現，高糖能促進人牙周膜成纖維細胞RAGE mRNA及蛋白表達，并促進促炎細胞因子IL-6、TNF-α的分泌，而RAGE抑制劑FPS-ZM1能顯著抑制高糖引起的IL-6、TNF-α分泌。本研究結果發現，高糖處理BAMs 12 h后，細胞RAGE、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA和蛋白水平以及上清液中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α濃度均顯著升高，并且抑制RAGE與TLR4能夠顯著抑制上述過程，與前人研究結果相符。

與NG組相比，*.P<0.05差異顯著，**.P<0.01差異極顯著；與HG組相比，#.P<0.05差異顯著，##.P<0.01差異極顯著Compared with NG group, *.P<0.05, **.P<0.01; Compared with HG group,#.P<0.05,##.P<0.01圖3 高糖及高糖與不同抑制劑共處理對BAMs IL-1β、IL-6及TNF-α釋放的影響Fig.3 Effects of high glucose and different inhibitor treatments on BAMs secretion of IL-1β, IL-6, TNF-α

RAGE與TLR4共享部分配體及下游炎癥信號通路，并在受體被激活時發生信號通路上的串擾，從而對下游部分信號通路產生協同激活作用[11, 23]。目前已有研究表明，RAGE與TLR4被激活后能夠對下游共同信號途徑如MAPK、NF-κB產生協同激活作用[24-25]，但能否協同激活更多的下游信號通路有待進一步研究。Sakaguchi等[13]研究指出，MyD88作為已知的TLR4下游關鍵接頭分子，可能與磷酸化的RAGE結合從而傳導來自RAGE的炎癥信號，但RAGE與TLR4能否協同激活MyD88尚不清楚。本研究發現，在高糖處理細胞前使用TLR4抑制劑TAK-242或RAGE抑制劑FPS-ZM1預處理BAMs 1 h，均能顯著抑制高糖引起的BAMs MyD88/NF-κB mRNA、蛋白表達上調以及促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，表明在高糖處理下，RAGE與TLR4能夠協同激活MyD88/NF-κB 信號通路，促進BAMs炎癥反應。另外，受體間串擾還表現為受體水平上的相互影響，主要表現出影響另一受體的功能、蛋白表達或跨膜轉運，不同TLR之間的串擾在巨噬細胞炎癥反應中發揮重要作用[26-27]，但尚未有RAGE與TLR4間受體相互影響的研究報道。本研究發現，TLR4抑制劑處理BAMs后能顯著抑制高糖引起的RAGE mRNA及蛋白表達上調，而RAGE抑制劑處理BAMs后能顯著抑制高糖引起的TLR4 mRNA及蛋白表達上調。即RAGE與TLR4互相影響另一受體的蛋白表達，表明RAGE與TLR4間存在著受體水平上的串擾，但RAGE與TLR4是否互相影響其受體功能和跨膜轉運有待進一步研究。在結果中還發現RAGE抑制劑FPS-ZM1相較于TLR4抑制劑TAK-242，能引起更進一步的TLR4表達抑制。TAK-242其主要功能并非抑制細胞TLR4表達，而是抑制細胞膜上TLR4的正常功能，引起下游MyD88/NF-κB信號減弱，通過負反饋調節使細胞TLR4表達受到抑制。而FPS-ZM1抑制RAGE正常功能后，也能引起MyD88/NF-κB信號減弱，但引起了更進一步的TLR4表達抑制，這可能說明RAGE除通過MyD88/NF-κB負反饋調節TLR4外，還存在其他串擾調控途徑，有待進一步深入研究。

4 結 論

高濃度的葡萄糖能夠通過RAGE-TLR4串擾引起BAMs釋放促炎細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α，促進炎癥反應。研究結果進一步闡明了高濃度葡萄糖促進細胞炎癥反應的分子機制，RAGE與TLR4間的串擾機制可能成為后續研究的主要方向。