BCG感染巨噬細胞后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對細胞焦亡的調(diào)控作用

聶雪伊，劉 蕾，鄭雪迪, 楊 易，徐金瑞*，王玉炯*

(1. 西部特色資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021； 2. 寧夏大學生命科學學院，銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)引起的慢性致死性人獸共患傳染病[1]。牛結(jié)核病是由牛結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的傳染性疾病，也能夠威脅人類的健康。據(jù)報道，大約有10%的人結(jié)核病是由牛結(jié)核分枝桿菌感染引起的[2]。近年來，隨著新型耐藥菌株的出現(xiàn)和HIV雙重感染及BCG免疫效果降低，TB的發(fā)病率及死亡率居高不下，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)WHO 2019年報告顯示，在全球范圍內(nèi)估計有1 000萬人患結(jié)核病，大多數(shù)發(fā)展為結(jié)核病患者(約90%)的是成年人，其中男性多于女性[3]。

巨噬細胞是 Mtb 感染早期免疫應(yīng)答的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在宿主抗Mtb感染免疫中起到關(guān)鍵作用，而Mtb也可通過阻止吞噬溶酶體的形成以逃避巨噬細胞的“追殺”[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的細胞器，對維持細胞穩(wěn)態(tài)起重要作用。多種刺激因素可以引起ERS，為緩解ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)維持細胞穩(wěn)態(tài)[5]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein-78，GRP78)，是UPR的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]。有研究表明，Mtb感染巨噬細胞后會誘發(fā)ERS[7-8]，如果UPR無法恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，可能會誘發(fā)程序性細胞死亡[9]。

在Mtb感染巨噬細胞的過程中除了可以誘發(fā)ERS，還可以通過細胞焦亡等方式，抑制病原菌在宿主體內(nèi)的擴散[10]。細胞焦亡(pyroptosis)是一種重要的先天免疫反應(yīng)，是介于壞死和凋亡之間的程序性細胞死亡模式，其主要的特征為細胞膜破裂，釋放諸多細胞因子和危險信號分子，激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[11]。細胞焦亡與阿爾茨海默病[12]、多發(fā)性硬化癥[13]、中風[14]等多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

然而，在Mtb感染巨噬細胞后，其誘發(fā)的ERS與細胞焦亡間的關(guān)系尚不明確。為此，本研究在BCG感染THP-1細胞后，通過抑制ERS，采用qRT-PCR、Western blot、ELISA、CCK-8等方法，對ERS和細胞焦亡的相關(guān)指標進行檢測，旨在揭示BCG感染THP-1細胞后ERS對細胞焦亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

細胞計數(shù)儀(BioRAD公司，美國)，實時熒光定量PCR儀Quantity Studio 5、NanoDrop-8000(賽默飛，美國)，GE Amersham Imager600自動化學發(fā)光成像儀(General Electric Company，美國)，Enspire熒光酶標儀(PerkinElmer公司，美國)，光學顯微鏡(Motic公司，中國)。

1.2 BCG培養(yǎng)

BCG購于成都生物制品研究所，培養(yǎng)步驟：配制含0.2% Tween-80的7H9培養(yǎng)液，高壓滅菌后，加入10% ADC Enrichment增菌液混勻。將BCG接種于已配制好的7H9培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，通過測定OD600 nm值確定BCG濃度。

1.3 細胞培養(yǎng)

人單核巨噬細胞THP-1細胞購于中國科學院細胞庫，培養(yǎng)步驟：THP-1細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和0.05 mmol·L-1β-巰基乙醇的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基中，當細胞密度達到80%～90%時，采用半換液法進行傳代，傳代后靜置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將含有50 ng·mL-1佛波酯的THP-1細胞按2×106個·孔-1接種在6孔板中，于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將其誘導(dǎo)分化成巨噬細胞，更換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)試驗。

1.4 BCG感染

BCG感染復(fù)數(shù)為10∶1，感染時間為0、2、6、12、24、48 h。在此基礎(chǔ)上，采用5 mmol·L-1TUDCA預(yù)處理細胞2 h，BCG感染24 h，分以下4個 組：對照組(C)、BCG感染組(BCG)、ERS抑制劑組(TUDCA)和BCG +ERS抑制劑組(BCG+TUDCA)。

1.5 qRT-PCR

按照試驗設(shè)計組處理細胞后，Trizol法提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(反應(yīng)體系：20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)，采用qRT-PCR方法(反應(yīng)體系：20 μL；反應(yīng)條件：采用“兩步法進行反應(yīng)”，第一步為94 ℃ 30 s；第二步為94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，44個循環(huán))檢測GRP78、GSDMD、Caspase1、NLRP3、IL-1β和IL-18等基因mRNA水平的表達(引物資料見表1)。

表1 qRT -PCR引物設(shè)計表格

1.6 Western bolt檢測

按照“1.3”和“1.4”中的方法處理細胞后，提取各組蛋白，用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度后。進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后濕轉(zhuǎn)至已用甲醇激活的PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，封閉后分別過夜孵育β-actin(1∶3 000 稀釋)、GRP78(1∶4 000稀釋)、Caspase12(1∶1 000 稀釋)、GSDMD(1∶1 000稀釋)、Caspase1(1∶1 000 稀釋)、NLRP3(1∶1 000稀釋)蛋白抗體，TBST洗滌6次，每次5 min，加熒光素偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體(1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，TBS洗滌3次，每次5 min，上機對蛋白表達量進行檢測[15]。

1.7 ELISA

收集各處理組細胞培養(yǎng)上清，根據(jù)相關(guān)因子細胞試劑盒說明書，按照操作步驟進行處理，用熒光酶標儀在450 nm測定吸光值，記錄結(jié)果。

總體來看，五圩地區(qū)構(gòu)造是由一群NNW走向呈弧形展布的壓扭性構(gòu)造形跡組合而成，這些構(gòu)造形跡走向上向南東在三只羊附近收斂，向NNW逐漸撒開，展示了五圩帚狀構(gòu)造的形態(tài)，砥柱就在雞峒小型隆起。從展布形式可以推斷五圩地區(qū)構(gòu)造是受順時針的一對SN向力偶作用而產(chǎn)生的。由于各地處的邊界條件不同，而產(chǎn)生不同方向的局部扭力，如五圩背斜西翼水落、三排洞一帶扭力方向是逆時針的，而東翼拉簡、九壘一帶為順時針的扭力。它們之間的關(guān)系就象齒輪銜接轉(zhuǎn)動一樣，一個反時針方向的扭動就帶動相鄰區(qū)的順時針方向扭動。在兩個不同方向扭動的交接部位，就產(chǎn)生一組扭裂帶。箭豬坡礦床就剛好在扭裂帶產(chǎn)生的部位，形成了箭豬坡礦床的構(gòu)造形態(tài)。

1.8 CCK-8

按1×104個·孔-1密度接種于96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照“1.4”試驗設(shè)計組處理細胞后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于3 h后使用熒光酶標儀在450 nm測定吸光值，并記錄其數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有試驗數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次獨立試驗的驗證，試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Priam 9.0軟件中的T-test或One Way ANOVA進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用Tukey：Compare all pairs of columns柱狀圖表示。圖中*代表顯著差異(P<0.05)，**代表差異極顯著(P<0.01)，***代表差異極顯著(P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 BCG感染巨噬細胞后ERS水平的檢測

BCG感染THP-1細胞不同時間后，采用qRT-PCR和Western blot檢測GRP78在mRNA水平和蛋白水平的表達，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，與未感染對照組相比，BCG感染組GRP78 mRNA水平的表達在2 h時差異不顯著，在6 h之后隨感染時間的延長顯著上調(diào)(圖1a，P<0.01)；GRP78蛋白的表達隨感染時間增加逐漸升高，48 h達到最高(圖1b、c，P<0.01)。上述結(jié)果表明，BCG感染巨噬細胞后引起ERS的發(fā)生。

a. qRT-PCR檢測GRP78 mRNA表達水平；b. Western blot檢測GRP78蛋白表達水平；c. GRP78灰度值分析。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001a. The mRNA expression of GRP78 detected by qRT-PCR; b. The protein expression of GRP78 detected by Western blot; c. Semi-quantification of GRP78. *. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001圖1 BCG感染THP-1細胞不同時間后GRP78表達水平Fig.1 The expression levels of GRP78 in THP-1 cells infected with BCG at different time

2.2 BCG感染后巨噬細胞焦亡的檢測

為探究BCG感染巨噬細胞后對細胞焦亡的影響，采用Western blot檢測GSDMD在蛋白水平的表達量，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，BCG感染THP-1細胞后，隨著感染時間的延長GSDMD的表達量逐漸增加，24 h達到最高，48 h表達量有所下降(P<0.001)，表明在BCG感染巨噬細胞24 h時細胞焦亡水平達到最高。

細胞發(fā)生焦亡現(xiàn)象后會在細胞膜上形成細胞膜孔洞，促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放。為此，采用qRT-PCR和ELISA分別檢測了IL-1β和IL-18在mRNA表達水平及在細胞培養(yǎng)上清中的濃度，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，IL-1β和IL-18在mRNA水平的表達和在細胞培養(yǎng)上清中的濃度均隨感染時間的增加而升高，12 h后均達到極顯著水平(P<0.01或P<0.001)。

2.3 BCG感染巨噬細胞后ERS對細胞焦亡的調(diào)控作用

在BCG單獨處理或與TUDCA共處理細胞24 h后，采用qRT-PCR和Western blot檢測ERS標志性分子GRP78和Caspase12的表達量，結(jié)果如圖4所示。由圖4a可見，與未感染對照組相比，BCG感染組GRP78在mRNA水平表達上調(diào)(P<0.001)，BCG和TUDCA共處理組與BCG感染組相比GRP78表達下調(diào)(P<0.01)。由圖4b～d可見，與未感染對照組相比，BCG感染組GRP78和Caspase12在蛋白水平表達上調(diào)(P<0.001)；與BCG單獨感染組相比，BCG和TUDCA共處理組GRP78和Caspase12蛋白表達下調(diào)(P<0.001)。以上結(jié)果說明TUDCA能有效抑制BCG感染THP-1細胞后ERS的產(chǎn)生。

a. Western blot檢測GSDMD蛋白表達水平；b. GSDMD灰度值分析。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001a. The protein expression of GSDMD detected by Western blot; b. Semi-quantification of GSDMD. *. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001圖2 BCG感染THP-1細胞不同時間后GSDMD表達水平Fig.2 The expression levels of GSDMD in THP-1 cells infected with BCG at different time

為探究BCG感染巨噬細胞后ERS對細胞焦亡的影響。采用qRT-PCR和Western blot檢測NLRP3、GSDMD、Caspase1在mRNA水平和蛋白水平的表達量，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，與未感染對照組相比，BCG感染組NLRP3、GSDMD、Caspase1在mRNA水平(圖5a～c)和蛋白水平(圖5d～g) 的表達均升高(P<0.05)，而與BCG單獨感染組相比BCG和TUDCA共處理組上述指標均顯著下降(P<0.01)。

采用qRT-PCR和ELISA檢測IL-1β和IL-18在mRNA水平的表達及在細胞培養(yǎng)上清中的濃度，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，與對照組相比，BCG感染組IL-1β和IL-18在mRNA水平的表達(圖6a、b)及在細胞培養(yǎng)上清中的濃度(圖6c、d)顯著上調(diào)(P<0.01)，而與BCG感染組相比，BCG和TUDCA共處理組IL-1β和IL-18的表達顯著下調(diào)(P<0.01)。

a、b. qRT-PCR檢測IL-1β和IL-18 mRNA表達水平; c、d. ELISA檢測IL-1β和IL-18 濃度*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001a,b. The mRNA expression of IL-1β and IL-18 detected by qRT-PCR; c,d. The concentration of IL-1β and IL-18 detected by ELISA assay kit. *. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001圖3 BCG感染巨噬細胞不同時間炎性因子的檢測Fig.3 Detection of inflammatory cytokines in THP-1 cells infected with BCG at different time

采用CCK-8檢測細胞活性，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，與對照組相比，BCG感染THP-1細胞后，細胞存活率降低(P<0.001)，而與BCG感染組相比，BCG和TUDCA共處理組細胞存活率上升(P<0.001)。

以上結(jié)果表明，BCG感染巨噬細胞引起ERS的產(chǎn)生，進而激活NLRP3炎性小體，介導(dǎo)巨噬細胞的焦亡。

a. qRT-PCR檢測GRP78 mRNA表達水平；b. Western blot檢測GRP78和Caspase12蛋白表達水平；c、d. GRP78和Caspase12灰度值分析。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001a. The mRNA expression of GRP78 detected by qRT-PCR; b. The protein expression of GRP78 and Caspase12 detected by Western blot; c,d. Semi-quantification of GRP78 and Caspase12. *. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001圖4 BCG感染THP-1細胞后TUDCA對ERS的影響Fig.4 The effect of TUDCA on ERS in THP-1 cells infected with BCG

3 討 論

迄今為止，結(jié)核病已成為世界重大公共衛(wèi)生問題之一，其主要的致病菌是Mtb。Mtb感染開始于遠端氣道，最終傳播到肺間質(zhì)。巨噬細胞是Mtb主要的宿主細胞與靶細胞，當Mtb入侵時，巨噬細胞會通過吞噬溶酶體的形成主動吞噬病原菌并與其發(fā)生復(fù)雜的相互作用[16]。此外，牛結(jié)核分枝桿菌也是引起人類結(jié)核病的病原之一。因此，深入研究Mtb的致病機制，將有助于進一步控制結(jié)核病的發(fā)病。

在真核細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類和糖類合成的基地，細胞內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白的積累以及細胞內(nèi)Ca2+的失衡等多種因素均可誘發(fā)ERS。ERS與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如動脈粥樣硬化[17]、糖尿病腎病[18]、帕金森病[19]、阿爾茲海默病[20]。已有研究表明，Mtb感染巨噬細胞會損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進而誘發(fā)ERS[7]。本研究結(jié)果顯示，在BCG感染巨噬細胞后ERS標志性分子的表達呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢，表明ERS與結(jié)核病的發(fā)生存在著內(nèi)在的聯(lián)系。

細胞焦亡的概念于2001年被提出，是一種炎癥性的細胞死亡方式[21]，涉及Caspase1介導(dǎo)的經(jīng)典途徑和Caspase4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑兩條途徑，活化的Caspase1/4/5 /11不僅可切割GSDMD為GSDMD-N，使其在質(zhì)膜上寡聚化形成細胞膜孔洞，還促進IL-1β和IL-18的成熟與釋放[11]。研究表明，有多種刺激因素可以促使細胞焦亡。對于胞內(nèi)菌感染導(dǎo)致的細胞焦亡而言，其主要的表現(xiàn)為促進機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，將更多的免疫細胞募集至感染病灶，這一過程有助于巨噬細胞清除胞內(nèi)菌抵抗感染[22]。有研究表明，Mtb作為一種典型的胞內(nèi)寄生菌，在感染巨噬細胞后會使細胞發(fā)生焦亡[23-24]。本研究結(jié)果顯示，BCG感染巨噬細胞后，細胞焦亡標志性分子GSDMD的表達上調(diào)，表明BCG感染巨噬細胞后，能夠引起細胞焦亡。

a、b. qRT-PCR檢測IL-1β和IL-18 mRNA表達水平; c、d. ELISA檢測IL-1β和IL-18 濃度。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001a, b. The mRNA expression of IL-1β and IL-18 detected by qRT-PCR; c, d. The concentration of IL-1β and IL-18 detected by ELISA assay kit. *. P<0.05，**.P<0.01，***. P<0.001圖6 BCG感染THP-1細胞后ERS對炎性因子的影響Fig.6 The effect of ERS on inflammatory cytokines in THP-1 cells infected with BCG

*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001圖7 BCG感染THP-1細胞后ERS對細胞增殖的影響Fig.7 The effect of ERS on cell proliferation in THP-1 cells infected with BCG

近年來研究發(fā)現(xiàn)，ERS與細胞焦亡之間存在復(fù)雜的相互作用聯(lián)系，NLRP3作為重要的先天免疫模式識別受體，在此過程中發(fā)揮重要作用[25]。已有研究證明，ERS參與了NLRP3炎性小體的活化[26-27]，而炎性小體活化又可引起細胞焦亡[23, 28]。NLRP3炎性小體是目前研究最多的炎性小體，能被多種類型的外源物質(zhì)或自身危險信號激活，其激活需要兩個信號：第一個信號，由損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)或病原菌相關(guān)分子模式(PAMPs)的識別所誘導(dǎo)啟動Pro-IL-1β和Pro-IL-18的表達；第二個信號由活化的NOD樣受體觸發(fā)PAMPs，促進炎癥小體的組裝，招募并激活Caspase1[29-30]?；罨腃aspase1剪切GSDMD，使GSDMD的N末端結(jié)構(gòu)域釋放，促進IL-1β和IL-18的成熟與釋放，引發(fā)細胞焦亡[31]。本研究為了揭示BCG感染巨噬細胞后ERS對細胞焦亡的影響，在用TUDCA處理巨噬細胞后，檢測了ERS相關(guān)分子、細胞焦亡相關(guān)分子、NLRP3、IL-1β和IL-18的表達差異。研究結(jié)果顯示，BCG感染巨噬細胞后上述分子表達上調(diào)，而TUDCA對上述反應(yīng)具有明顯抑制作用，表明在BCG感染巨噬細胞后誘發(fā)的ERS對細胞焦亡具有一定的調(diào)控作用。

綜合以上研究結(jié)果，表明在BCG感染巨噬細胞后，誘發(fā)了ERS的產(chǎn)生，進而引起巨噬細胞的焦亡(圖8)，本研究結(jié)果將為結(jié)核病的發(fā)病機制提供新的視角。

圖8 BCG感染巨噬細胞后ERS對細胞焦亡調(diào)控的可能機制Fig.8 Proposed model for funcational mechanism of ERS in regulating of pyrotosis after BCG infected macrophages

4 結(jié) 論

BCG感染巨噬細胞后引起了ERS的產(chǎn)生和NLRP3炎性小體的活化，并進一步介導(dǎo)了巨噬細胞的焦亡。