GnIH過表達載體構建及其對小鼠睪丸間質細胞的作用研究

湯亞茹，陽美霞，賈金美，張虹亮，王水蓮

(湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128)

睪丸間質細胞集中散布于睪丸曲精小管間的疏松結締組織內，主要參與睪酮的合成與分泌，雄性機體內睪酮95%由睪丸間質細胞分泌，睪酮在維持雄性動物的生殖器官分化、雄性動物的第二性征、雄性副性腺的發育和功能以及維持精子發生中起著重要的作用[1-2]；睪丸間質細胞的數量、形態改變和合成分泌睪酮的功能下降都會引起一系列的生殖障礙疾病[3]。

促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)是最初由Tsutsui等[4]在鵪鶉下丘腦中發現的一類含有精氨酰-苯丙酰胺(RF酰胺)的神經肽，在哺乳動物中，GnIH同源物為RF酰胺相關肽-3(RFamide-relatedpetide，RFRP-3，別稱Npvf)，具有拮抗下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)的作用[4-7]。有報道稱，GnIH不僅對動物攝食[8]、行為[9]、應激[10]、能量代謝[11]和生物節律[12]有調節作用，而且對動物生殖活動也有重要的調節作用。相關研究表明，哺乳動物的GnIH可通過下丘腦作用于GnRH神經元來抑制促性腺激素的釋放與合成[13]，還可直接作用于垂體來抑制促性腺激素(FSH和LH)的合成和分泌[14-15]，進而抑制動物的生殖。GnIH可參與雌性動物季節性發情調節和發情時期轉換[16]；影響卵泡的發育、凋亡和黃體化[17]；影響顆粒細胞的增殖和卵巢類固醇的生成[17-18]，從而影響雌性哺乳動物生殖。GnIH還可影響附睪的組織學變化、生殖細胞數量、精子的生成和睪酮水平[19-20]，從而影響雄性哺乳動物生殖。但是，GnIH對睪丸間質細胞生長發育的直接影響和對睪丸間質細胞睪酮分泌的機制研究尚不完全清晰。本研究通過構建GnIH過表達載體并體外轉染小鼠睪丸間質細胞，探究其對小鼠睪丸間質細胞(TM3細胞系)凋亡的效應及睪酮合成的調節作用，為揭示GnIH在雄性哺乳動物生殖調控過程中的作用及機制提供科學理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

成熟的6～8周雄性ICR小鼠購自斯萊克景達公司。根據美國國立衛生研究院指南對所有小鼠進行實驗動物的護理和使用。飼養環境溫度維持在(22±3)℃，相對濕度為50%～70%，并保持12 h的明暗循環。給小鼠飼喂標準日糧并自由飲水。TM3細胞系由本實驗室凍存。

1.2 主要試劑

質粒PLVX-IRES-ZsGreen1從長沙市贏潤生物公司購買；DH5α感受態細胞、反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa公司；EcoR Ⅰ內切酶、BamH Ⅰ內切酶、無內毒素質粒大提取試劑盒、無內毒素質粒小提取試劑盒購自康為試劑公司；RNA提取試劑盒購自天恩澤公司；胎牛血清購自Gibco公司；Opti-MEM、LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；0.25%胰蛋白酶購自碧云天生物技術研究所；DME/F-12(1∶1)培養基購自浙江天杭生物科技有限公司；小鼠睪酮含量測定試劑盒購自武漢華美公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自吉凱生物。

1.3 GnIH過表達載體的構建與鑒定

小鼠脫頸處死后取睪丸組織，按RNA提取試劑盒說明書提取睪丸組織RNA。將組織RNA用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA(-20 ℃保存)。用表1設計的目的基因GnIH特異性引物(含EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位點及保護堿基)進行目的基因的擴增、純化及回收。用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切回收的目的片段和表達載體PLVX-IRES-ZsGreen1酶切產物，用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴連接過夜。產物轉化入DH5α 感受態，Amp+LB平板培養，挑取8個單菌落擴大培養，進行質粒小提，質粒分別進行酶切驗證并送至華大基因公司測序鑒定。鑒定出的正確陽性菌株(含GnIH過表達質粒)再擴大培養，采用全式金無內毒素質粒大提試劑盒提取質粒(-20 ℃保存)。

表1 GnIH基因引物序列

1.4 TM3細胞培養

復蘇并培養TM3細胞(離心去除上清二甲基亞砜DMSO；DME/F-12+5% FBS+1%青鏈霉素)，細胞長至90%時進行1∶1傳代(含0.25%EDTA的胰酶消化)和培養，至少傳兩代。試驗前將細胞消化、重懸并接種至新的培養板培養。

1.5 質粒轉染

TM3細胞以5×105個·孔-1密度鋪板于六孔板中，當細胞融合率到達80%左右時更換為無雙抗無血清培養基(DME/F-12)饑餓處理2～4 h，轉染步驟參照Lipofectamine TM 2000說明書進行，試驗分為2組：PLVX-IRES-ZsGreen1質粒轉染組(空質粒組)，PLVX-IRES-ZsGreen1-GnIH過表達質粒轉染組(GnIH過表達組)，每組3個重復。轉染后培養72 h，顯微鏡視野下觀察熒光并收集細胞和上清液。

1.6 過表達GnIH對TM3細胞凋亡率影響

不同質粒轉染TM3細胞72 h后收集各組細胞樣，參照凋亡試劑盒說明書PI/FITC雙染色法原理進行試驗，最后利用流式細胞儀檢測TM3細胞凋亡情況，并計算凋亡率。

1.7 TM3細胞睪酮分泌含量測定

收集轉染72 h后空質粒組和GnIH過表達組的細胞上清液，采用武漢華美小鼠睪酮試劑盒測定各組中睪酮含量，具體步驟按說明書進行；在450 nm波長處依次測量各孔的吸光度(OD值)，并計算睪酮濃度。

1.8 實時熒光定量PCR檢測基因表達

收集空質粒組和GnIH過表達組質粒轉染后的TM3細胞，提取細胞RNA，逆轉錄后以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，檢測GnIH、睪酮合成相關酶基因(StAR、P450 scc、3β-HSD、17β-HSD和P450c17)和凋亡相關基因(Bax、Bcl-2和P53)mRNA 表達量變化。RT-PCR體系為：SYBR?Premix Ex Taq(2×)10 μL、Forward Primer(10 μmol·L-1)0.2 μL、Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.2 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA 2 μL、 dH2O 7.2 μL。 反應條件： 95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、 57 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、61 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、40個循環， 最后利用CT值分析結果(β-actin作為內參)。基因引物序列如表2所示。

表2 qRT-PCR反應引物序列

1.9 統計學分析

所有試驗都獨立重復3次，結果用“平均值±標準誤(Means±SEM)”表示。所有數據統計分析均使用SPSS19.0軟件進行，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。兩組之間的差異顯著性比較用獨立樣本t檢驗進行分析。

2 結 果

2.1 GnIH過表達質粒PCR和測序鑒定

陽性質粒GnIH過表達質粒經內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后切下約567 bp的GnIH基因片段和8 204 bp的載體片段，條帶較明顯(圖1A)。GnIH過表達質粒送至華大基因公司進行序列測定，將測序所得的序列在NCBI中進行序列比對，顯示構建序列與目的基因堿基序列一致(圖1B)，表明GnIH過表達質粒構建成功。

A. GnIH過表達質粒雙酶切電泳圖，泳道1.1 kb Plus DNA Ladder;泳道2.空質粒雙酶切;泳道3.GnIH過表達質粒雙酶切;泳道4.Trans2K DNA Marker. B. GnIH過表達質粒測序后比對結果，Query.比對序列; Sbjct.目標序列A. Dual-enzyme digestion of GnIH overexpression plasmid electropherogram, Lane 1. 1 kb Plus DNA Ladder; Lane 2. Dual-enzyme digestion of empty plasmid; Lane 3. Dual-enzyme digestion of GnIH overexpression plasmid; Lane 4. Trans2K DNA marker. B. Result of sequence comparison of GnIH overexpression plasmid, Query. Alignment sequence; Sbjct. Target sequence圖1 GnIH過表達質粒PCR和測序鑒定Fig.1 PCR and sequencing identification of GnIH overexpression plasmid

2.2 質粒轉染效率鑒定

空載體質粒和GnIH過表達質粒轉染TM3細胞72 h，熒光顯微鏡觀察各孔細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，各組轉染效率為60%左右(圖2A、B)，滿足后續實驗的要求。轉染72 h后收集細胞，用qRT-PCR法檢測不同轉染組TM3細胞中GnIH基因的表達量，結果顯示，過表達組GnIHmRNA與空質粒組相比極顯著升高(P<0.01)，表明GnIH過表達載體構建成功并在TM3細胞中表達(圖2C)。

A. 空質粒組；B. GnIH過表達組；C. GnIH mRNA的相對表達量；組間比較:*.P<0.05;**.P<0.01.下同A. Empty plasmid group; B. GnIH overexpression group; C. Relative expression of GnIH mRNA; Comparison among groups:*.P<0.05;**.P<0.01.The same as below圖2 質粒轉染效率鑒定Fig.2 Plasmid transfection efficiency identification

2.3 過表達GnIH對TM3細胞凋亡的影響

空載體質粒和GnIH過表達質粒轉染TM3細胞72 h后收集細胞，用流式細胞術和qRT-PCR法分別檢測不同轉染組細胞凋亡情況和細胞凋亡相關基因P53、Bax/Bcl-2 mRNA的表達情況。結果表明，細胞轉染不同質粒后，過表達組細胞凋亡率(20.38±1.20)%相比于空質粒組細胞凋亡率(7.24±0.59)%顯著增加，且差異極顯著(P<0.01,圖3C)；與空質粒組相比，GnIH過表達組P53 mRNA表達量極顯著上調(P<0.01)；過表達組Bax/Bcl-2比值與空質粒組相比極顯著增大(P<0.01,圖3D)。

2.4 過表達GnIH對TM3細胞睪酮合成與分泌的影響

空載體質粒和GnIH過表達質粒轉染TM3細胞，72 h后收集細胞培養液和細胞，用ELISA和qRT-PCR法分別檢測不同轉染組睪酮分泌水平和睪酮合成相關酶基因(StAR、P450scc、3β-HSD、17β-HSD和P450c17)mRNA表達水平。結果表明，與空質粒組相比，過表達組睪酮分泌水平極顯著下降(P<0.01,圖4A)；過表達組StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表達量與空質粒組相比顯著降低(P<0.05)，P450 scc mRNA表達量與空質粒組相比極顯著降低(P<0.01)，17β-HSDmRNA表達量在兩組間差異不顯著(P>0.05,圖4B)。

3 討 論

在雄性動物中，睪丸間質細胞的凋亡會嚴重影響雄性動物的生殖[1-3]。現有文獻報道稱，GnIH也可影響雄性生殖，如誘導雄性成年鳥類的睪丸凋亡和曲細精管退化[21]；誘導大鼠附睪細胞凋亡[19]；影響小鼠生殖細胞的增殖和凋亡來抑制精子形成[20]。Bax、Bcl-2、P53均是參與調控細胞凋亡的關鍵細胞因子，Bcl-2是一種具有抑制凋亡作用的癌基因，而Bax是具有促進細胞凋亡作用的基因，兩者可通過形成二聚體而發揮調控細胞凋亡的作用[22-23]。Bax與Bcl-2兩基因表達量的比值體現了細胞生理情況，比值升高說明細胞趨向于凋亡，而比值降低表明細胞趨向于健康狀態[24-25]。P53同樣作為促進細胞調亡的關鍵基因，是Bax與Bcl-2的上游調控基因，正常情況下P53可以上調Bax和下調Bcl-2的表達來促進細胞發生凋亡[26-28]。在褪黑素對睪丸間質細胞凋亡影響的研究中發現，細胞內Bcl-2表達水平上升， Bax表達水平下降[29]。但目前尚無GnIH與睪丸間質細胞關系的研究。本研究也證實了GnIH過表達組細胞凋亡率顯著增加，Bax/Bcl-2比值過表達組顯著高于空質粒轉染組，過表達組P53 mRNA表達量也顯著上調。這些結果說明GnIH對睪丸無論是精子形成還是間質細胞發育均有抑制作用。

A.空質粒組；B. GnIH過表達組；C. 細胞凋亡率統計圖；D. 凋亡相關基因表達水平A.Empty plasmid group; B. GnIH overexpression group; C. Apoptosis rate statistics chart; D. Apoptosis-related gene expression level圖3 過表達GnIH對TM3細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of overexpression of GnIH on the apoptosis in TM3 cells

機體內的睪酮主要由睪丸間質細胞合成[1-3]。本研究構建了GnIH過表達重組質粒，轉染至TM3細胞72 h后發現，GnIH能抑制睪丸間質細胞睪酮的合成。這一結果與Anjum等[20]和Zheng等[30]研究報道一致。目前，GnIH抑制睪丸間質細胞睪酮合成的機理研究較少，本研究檢測了間質細胞中類固醇合成相關酶基因水平，結果表明，過表達組睪酮合成酶基因StAR、P450scc、3β-HSD和P450c17 mRNA表達量與空質粒轉染組相比顯著降低，這一結果更進一步證明GnIH能抑制睪酮合成。

A.GnIH過表達對TM3細胞睪酮分泌的影響；B. GnIH過表達對TM3細胞睪酮合成相關酶基因表達的影響A.Effect of GnIH overexpression on the secretion of testosterone in TM3 cellsl; B. Effect of GnIH overexpression on gene expression of testosterone synthesis-related enzymes in TM3 cells圖4 GnIH過表達對TM3細胞睪酮合成與分泌的影響Fig.4 Effect of GnIH overexpression on the synthesis and secretion of testosterone in TM3 cells

4 結 論

本研究成功構建了GnIH過表達載體，GnIH過表達可誘導TM3細胞凋亡，抑制睪酮合成相關酶的表達，進而抑制睪酮分泌。