NPFFR1基因對鵝卵泡顆粒細胞激素分泌和細胞凋亡的影響研究

張克山，高廣亮，李 琴，趙獻芝,李 靜，王啟貴*

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460； 2. 重慶市肉鵝遺傳改良工程技術研究中心，重慶 402460)

鵝的低繁殖力是養鵝業產業化發展的關鍵制約因素，如何提高鵝的產蛋數是當前鵝遺傳育種的主要任務，鵝的產蛋數直接受成熟卵泡數量影響。鵝卵泡發育是一個逐級發育過程，在這個過程中絕大多數會因細胞凋亡而閉鎖，僅少數被選擇優勢化而成熟排卵，其中激素是最重要的維持因子之一[1-3]。促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)是下丘腦神經肽的一種，也是目前發現的唯一一種對卵巢發育起抑制作用的神經肽[4-5]，通過結合G蛋白偶聯受體NPFFR1在下丘腦-垂體-卵巢軸或卵巢水平直接參與調控性行為、發情周期、雌激素循環和卵泡發育等繁殖相關進程[6-10]。家禽的卵泡成熟存在著周期節律程序，周期節律調控分子又與激素分泌、細胞增殖凋亡存在分子偶聯[11-13]。Kim等[14]研究發現，促性腺激素抑制激素抑制顆粒細胞Fas/FasL表達水平，促進P53表示，抑制細胞凋亡。Sen和Hoffmann[15]研究了核心周期調控基因Clock、Bmal1和Per等在激素釋放和生殖軸靶組織激素敏感性中的作用，證實下丘腦(視交叉上核、kisspeptin和GnRH神經元)、垂體(促性腺激素)、卵巢(卵泡膜和顆粒細胞)、睪丸(leydig細胞)以及子宮(子宮內膜和子宮肌層)的激素釋放與靶組織的激素敏感性受到周期節律基因調控。Kelleher等[16]研究發現，核心晝夜節律基因調控細胞周期基因(c-Myc、Wee1、cyclinD和p21)的表達。Angelopoulou等[17]研究發現，小鼠下丘腦中的GnIH同源類似物NPFF通過NPFFR1受體及其典型信號通路(Gi/o蛋白和G蛋白偶聯的內向整流鉀通道)抑制GnRH神經元的興奮性，參與晝夜節律、季節性繁殖和社會行為調控。

總之，卵泡的發育是一個由激素及其受體、細胞增殖分化及凋亡、周期節律等互作調控的過程，本試驗研究NPFFR1在等級前卵泡顆粒細胞過表達對卵泡顆粒細胞激素分泌和細胞凋亡的影響，并通過轉錄組測序篩選與卵泡發育相關的重要差異表達基因，揭示其內在的基因互作網絡。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取9只健康產蛋期42周齡四川白鵝進行屠宰，按直徑大小采集等級前小白卵泡(2～4 mm, small white follicle, SWF)、大白卵泡(4～6 mm, large white follicle, LWF)、小黃卵泡(6～8 mm, small yellow follicle, SYF)、大黃卵泡(8～10 mm, large yellow follicle, LYF)和F5～F1等級卵泡，劃破卵泡釋放卵泡液或卵黃，PBS緩沖液輕輕漂洗卵泡，直至分離顆粒細胞層，立即置于液氮中速凍后轉放入-80 ℃冰箱保存、備用，以進行組織總RNA抽提。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購自Qiagen公司(73404，德國)；Q5熱啟動超保真DNA聚合酶(M0494S，美國))和平末端/TA 連接酶預混液(M0367S，美國) 購自NEB公司；限制性內切酶EcoR I、Hind Ⅲ、pMD19-T Simple 和DNA Marker DL2000均購自寶生物(大連)工程有限公司；DNA片段凝膠回收試劑盒和質粒快速抽提純化試劑盒購購自Omega(美國)公司；GnIH激素購自 phoenix pharmaceuticals公司；反轉錄試劑Promega GoScriptTM Reverse Transcription System (A5001，美國)和熒光定量試劑GoTaq?qPCR Master Mix(A6001，美國)均購自Promega公司；DMEM/F12培養基、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、胎牛血清、膠原酶均購自ThermoFisher Scientific公司；一步法TUNEL檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。TOP10感受態細胞和pcDNA3.1(+)質粒由重慶市畜牧科學院家禽研究所分子實驗室保存。

1.3 NPFFR1在四川白鵝各級卵泡顆粒細胞中 RT-qPCR分析

根據NCBI上發表的鵝NPFFR1基因序列(登錄號：XM_013172544.1)，用Primer primer5.0設計引物，引物序列見表1；按“1.1”的方法分離顆粒層，將分離的顆粒層用Qiagen試劑盒提取細胞的總RNA，利用GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒進行反轉錄，獲得各樣品的cDNA。利用設計的NPFFR1定量引物對cDNA模板進行qPCR檢測。反應體系：2× GoTaq?qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板cDNA 1 μL， CXR Reference Dye 0.2 μL，ddH2O 3.4 μL。擴增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40個循環。以GAPDH為內參基因，ABI7900H進行熒光定量檢測，2-ΔΔCt法計算NPFFR1 mRNA基因在各階段卵泡細胞中的相對表達量。

表1 引物序列

1.4 NPFFR1基因CDS區克隆及真核表達載體構建

以卵巢組織cDNA為模板，設計合適的擴增引物克隆NPFFR1基因的CDS區，反應體系：Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL， ddH2O 22 μL。擴增條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 2 min；16 ℃ 5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測后，用膠回收試劑盒回收產物，連接T載體進行克隆測序，將測序結果正確的序列用Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切后，克隆到pcDNA3.1(+)質粒中，構建pcDNA-NPFFR1質粒，送樣測序，將測序結構正確的質粒擴大培養，去內毒素抽提質粒，保存于-20 ℃，以備轉染用。

1.5 NPFRR1基因過表達對顆粒細胞激素分泌的影響

取健康同批次產蛋四川白鵝(42周齡)的卵巢，同“1.3”中方法分離等級前和等級卵泡顆粒層，VI膠原酶充分消化分散細胞，將分散的細胞分別接種到含10%完全培養基的12孔細胞培養板中，每孔接種量5×105個，待細胞融合度達到70%后，LipofectamineTM3000 Transfection Reagent進行質粒轉染，每孔質粒量1 μg，重復9個孔，設立空載對照。將轉染72 h的細胞收集上清液和細胞沉淀，上清液送上海恒遠公司，ELASA法檢測細胞上清液中雌二醇(estradiol, E2)、孕酮(progesterone, P4)和抗繆勒管激素(anti-Mullerian hormone, AMH)的含量；一部分細胞沉淀經裂解，提取總RNA，一部分細胞收集，-80 ℃保存備用。

1.6 顆粒細胞過表達NPFFR1基因的轉錄組測序與分析

分離自大黃卵泡(8～10 mm)的顆粒細胞同“1.5”中的方法轉染構建pcDNA3.1-NPFFR1質粒，設立空載對照，每個處理重復3個孔，72 h后收集細胞送百邁克生物測序公司進行轉錄組測序，測序方法和數據處理方法見課題組前期研究[18-19]，Illumina Hiseq2000測序，注釋參考鵝基因組來自于本課題組測序拼裝[20]，篩選差異表達基因(fold change≥2，FDR<0.05)，獲得的差異表達基因列表上傳MetaScape網站(http://metascape.org)，選擇小鼠進行基因功能聚類分析。

1.7 NPFFR1基因過表達對顆粒細胞凋亡的影響

按照“1.5”的方法獲得等級前卵泡(8～10 mm)顆粒細胞，接種到96孔細胞培養板中，每孔接種5× 104個，待細胞融合度達到70%后，LipofectamineTM3000 Transfection Reagent進行質粒轉染，每孔質粒量100 ng，重復4個孔，設立空載對照。細胞轉染72 h后采用廣州銳博生物科技公司生產的一步法TUNEL檢測試劑盒按使用說明檢測細胞凋亡情況，隨機取3個點，用ImageJ軟件處理熒光信號強度。

1.8 數據分析

利用SPSS17.0軟件GLM模塊對試驗數據進行方差分析，試驗結果以“平均值±標準差”的形式表示，采用單因素方差分析，用LSD法和Duncan法進行多重比較和差異性子集分類，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 NPFFR1 mRNA在四川白鵝各級卵泡顆粒細胞中的相對表達量

NPFFR1 mRNA在四川白鵝各級卵泡顆粒細胞中的相對表達量結果如圖1所示，NPFFR1在各階段卵泡顆粒細胞中均有表達，在等級前各階段均處于低水平表達，但卵泡進入等級階段發育后，NPFFR1表達量極顯著上升(P<0.01)，在F5階段達到高峰，隨后逐漸下降，直到進入排卵前卵泡F1階段，出現極顯著下調表達(P<0.01)。

相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，不同字母代表差異顯著(P<0.05)，大小寫字母間代表差異在P<0.01水平顯著The same letter means not significant difference(P>0.05), the different letters mean significant difference (P<0.05), the difference between upper and lower case letters means that the difference is extremely significant at the level of P<0.01圖1 四川白鵝NPFFR1 mRNA在各等級前和等級卵泡顆粒細胞中的相對表達量Fig.1 The mRNA expression level of NPFFR1 in follicular granulosa cells of Sichuan white geese

2.2 鵝NPFFR1基因CDS區克隆及pcDNA3.1(+)-NPFFR1真核表達質粒載體構建

NPFFR1特異性引物PCR擴增后產物經瓊脂糖凝膠檢測獲得了單一的特異性條帶，大小與預期目的條帶1 200 bp相符(圖2A)，將測序結果正確的片段經雙酶切后插入pcDNA3.1(+)空載體中，質粒酶切結果如圖2B所示，成功構建了pcDNA3.1(+)-NPFFR1真核表達質粒載體；將構建成功的質粒轉染卵泡顆粒細胞，RT-PCR檢測過表達效率，結果如圖2C所示，顆粒細胞轉染pcDNA3.1(+)-NPFFR1質粒后，NPFFR1極顯著上調表達(P<0.001)。

2.3 NPFFR1過表達對鵝卵泡顆粒細胞分泌激素的影響

ELISA檢測鵝卵泡顆粒細胞過表達NPFFR1基因后，細胞培養上清液中E2、P4和AMH 的含量，結果如表2所示，過表達NPFFR1后，對等級前卵泡顆粒細胞分泌E2無顯著影響(P>0.05)，但顯著下調等級卵泡顆粒細胞E2濃度(P<0.05)；過表達NPFFR不論是對等級前還是等級后顆粒細胞P4分泌都沒有顯著影響(P>0.05)，但不論是否過表達NPFFR1，等級前顆粒細胞上清液的P4含量顯著高于等級階段顆粒細胞(P<0.05)；過表達NPFFR1顯著減少了等級前顆粒細胞分泌AMH(P<0.05)，而對等級顆粒細胞影響不顯著(P>0.05)。

表2 顆粒細胞上清液中E2、P4和AMH的含量

A. NPFFR1基因完整CDS區擴增結果；B. 構建的pcDNA3.1-NPFFR1質粒雙酶切鑒定；C. 顆粒細胞過表達NPFFR1效率檢測。***. P<0.001A. The cloning result of the CDS region in NPFFR1; B. The pcDNA3.1-NPFFR1 plasmid confirmed by dual-enzyme digestion; C. The transfection efficiency of the pcDNA3.1-NPFFR1 plasmid in the granulosa cells.***. P<0.001圖2 NPFFR1基因真核表達載體構建和過表達效率檢測Fig.2 Construction of the pcDNA3.1(+)-NPFFR1 plasmid and its overexpression in the granulosa cells

2.4 NPFFR1基因對卵泡細胞凋亡的影響

顆粒細胞過表達NPFFR1后，相比于對照組，紅色熒光信號增強，TUNEL染色陽性的細胞數明顯多于對照組(圖3)。過表達NPFFR1，促進了顆粒細胞的凋亡。

圖3 過表達NPFFR1對顆粒細胞凋亡的影響(400×)Fig.3 Effect of NPFFR1 overexpression on apoptosis of granulosa cells(400×)

2.5 轉錄組數據分析結果與驗證

顆粒細胞過表達NPFFR1前后，轉錄組測序數據與參考基因組比對結果如表3所示，匹配率介于87.90%～89.49%。共篩選到267個差異表達基因，其中148個顯著上調，119個顯著下調。對這些差異表達基因進行功能聚類分析后發現，其主要富集到胞內進程(GO：00009987)、繁殖進程(GO:0022414)、生物調節(GO:0065007)、細胞增殖(GO:0008283)、節律進程(GO:0048511)等，篩選與卵泡發育密切相關的基因AMH、FOS(proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit)、Clock(clock circadian regulator)、ANTXR2(cell adhesion molecule 2)和Per(period circadian regulator)等進行qPCR驗證，結果顯示(圖4)，AMH顯著下調表達(P<0.05)，FOS、Clock、ANTXR2和Per分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)上調表達，與測序結果相一致。

表3 顆粒細胞過表達NPFFR1基因轉錄組數據與參考鵝基因組的匹配率

3 討 論

本研究發現，NPFFR1基因在各級卵泡顆粒細胞中均有表達，在卵泡由等級前向F5等級卵泡發育過程中，顆粒細胞中的NPFFR1極顯著上調表達(P<0.01)，在排卵的F1級階段，又出現顯著下調表達(P<0.05)，提示NPFFR1可能直接參與了卵泡發育的這些重要過程。目前已有大量試驗表明，禽類和哺乳動物中GnIH的同源類似物RFRP3，除了在下丘腦抑制GnRH神經元激活以釋放促性腺激素[21-23]，在卵巢組織也局部表達，可抑制許多脊椎動物的類固醇生成和卵泡發育[24-26]。

A.鵝卵泡顆粒細胞過表達NPFFR1基因后功能變化；B.Real-time PCR方法驗證差異表達基因A.The gene function enrichment for the differentially expressed genes in the granulosa cells overexpressed NPFFR1; B.The validation of DEGs by real-time PCR圖4 顆粒細胞過表達NPFFR1轉錄組數據分析與驗證Fig.4 Analysis and validation of transcriptome data of NPFFR1 overexpression in granulosa cells

Henningsen等[27]研究發現，在敘利亞倉鼠中，RFRP3及其受體NPFFR1強烈受到光周期調控，通過kisspeptin節律性地調節促排卵黃體生成激素分泌；Biran等[28]證實，RFRP3及其受體(NPFFR1和NPFFR2)在貓卵巢中表達，低濃度RFRP3能降低體外培養的腔前卵泡存活率，促進孕酮分泌。家禽的卵泡發育是一個等級發育過程，大量的卵泡在等級前卵泡發育過程中會凋亡閉鎖，只有極少數卵泡被選擇優勢化進入等級卵泡發育成熟并排卵，這個過程中顆粒細胞發揮著重要作用[29]。現有的研究表明，等級前顆粒細胞不論在形態還是功能上都與等級顆粒細胞有著明顯差異[30-32]。本研究發現，在鵝等級卵泡顆粒細胞中過表達NPFFR1可顯著下調雌二醇分泌(P<0.05)，而對AMH分泌，在兩個階段的顆粒細胞則出現與E2相反的結果；盡管過表達NPFFR1對等級前后顆粒細胞分泌的P4影響均不顯著，但由表2可知，等級前顆粒細胞和等級顆粒細胞分泌P4濃度存在著顯著差異(P<0.05)，這也進一步提示，NPFFR1對卵泡顆粒細胞激素分泌的影響存在階段性差異。

為了進一步研究NPFFR1過表達對顆粒細胞的作用，本研究使用轉錄組測序的方法，篩選了一些與卵泡發育密切相關的繁殖進程(GO:0022414)相關的重要差異表達基因，其中包含AMH、FOS、Clock和Per等。AMH是由早期發育階段卵泡顆粒細胞特異性產生的一種性激素，其血清含量是原始卵泡池大小的一個重要指標[33]，在人類中直接影響著婦女的生殖時長[34-35]，在本研究中，NPFFR1過表達抑制了顆粒細胞AMH的濃度，佐證了NPFFR1作為GnIH受體對繁殖的抑制作用。FOS是細胞增殖凋亡的重要調節基因，在卵泡發育中，FSH、LH等促性腺激素都可快速而短暫的促進卵泡顆粒細胞表達FOS，在排卵前起促進前列腺素釋放的作用[36-37]。生物節律在大多數組織細胞中廣泛存在，Fahrenkrug等[38]首先在大鼠的卵巢上發現一個晝夜節律鐘，其核心鐘基因Per1和Per2在24 h內有顯著的震蕩節律表達現象。Sellix[39]研究發現，卵巢的每一種細胞類型，包括卵泡膜細胞、顆粒細胞和卵母細胞，都有一個與卵泡生長、類固醇激素合成和排卵過程有關的分子鐘，使得卵泡發育有著明顯的時序性；Chen等[40]也證實，人卵巢的晝夜節律時鐘與類固醇生成之間存在潛在的關系，睪酮影響顆粒細胞晝夜節律基因表達。本研究發現，過表達NPFFR1顯著或極顯著(P<0.05或(P<0.01))上調了Clock和Per的表達。進一步檢測細胞凋亡情況，發現過表達NPFFR1使得凋亡熒光信號強度增強，細胞凋亡數量增加，而節律基因與細胞的增殖凋亡是密切相關的。Wang 等[41]給雄性大鼠睪丸內注射不同劑量的RFRP3引起了大鼠的劑量依賴性組織學改變：附睪管等精子數量減少，變性增多，附睪上皮細胞空泡化，誘導細胞凋亡和自噬相關基因caspase-3、Bcl-2、Beclin-1和Atg5的表達。Anjum等[42-43]研究表明，RFRP3結合其受體顯著降低了睪丸細胞增殖和存活標志物(如PCNA和Bcl2)水平，增加了凋亡標志物如caspase3和PARP蛋白表達，抑制LHR和甾體生成酶、P450 scc和3β-HSD表達，抑制甾體的生成。NPFFR1上調了核心節律基因表達，并促進了顆粒細胞的凋亡，由此推測，顆粒細胞NPFFR1與核心節律基因可能存在著功能上的互作，這種互作影響卵泡顆粒細胞的凋亡。

4 結 論

在等級前和等級顆粒細胞中過表達NPFFR1基因，分別顯著抑制了等級前和等級顆粒細胞內AMH和E2分泌，促進了顆粒細胞凋亡，調控了核心節律基因Clock和Per的轉錄水平，鑒于細胞凋亡、激素分泌與生物鐘節律基因間的分子與功能耦合，推測NPFFR1可能從激素、細胞凋亡和生物節律等多個環節影響卵泡顆粒細胞，參與調控卵泡的時序等級發育。