豪豬血蜱卵蛋白成分初步鑒定及其功能分類

劉金寶，程天印

(湖南農業大學動物醫學院， 長沙 410128)

蜱是一類以吸血為生的體外寄生蟲，其生活史包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱4個階段。在卵期，受精卵經過卵裂、囊胚、原腸胚、分節等過程發育成幼蜱，并破殼而出，其間發生的反應眾多而有序、參與的物質復雜而有定，尚能探明對了解蜱類胚胎發育規律，創新控蜱策略具有重要意義。

人們很早就已開始了蜱卵原生質組成和胚胎發育過程的研究。1943年，Wigglesworth[1]首先關注蜱卵顏色與血紅素的關系。隨后，Bremner[2]證實了蜱卵中的色素取決于球蛋白與血紅素結合而成的復合物。迄今為止，人們已經從安氏矩頭蜱[3]、毛白鈍緣蜱[4]、變異矩頭蜱[5-6]、肩突硬蜱[7]、微小扇頭蜱[8]、長角血蜱[9]卵中分離鑒定了多種卵黃蛋白，以及催化卵黃蛋白和血紅蛋白分解的微小扇頭蜱的heme-binding aspartic proteinase[10]、BoophilusYolk pro-Cathepsin[11]、vitellin-degrading cysteine endopeptidase[12]、毛白鈍緣蜱的cathepsin L-like proteinase[13]。最近，人們又發現了參與糖類代謝的GSK-3[14]、能清除自由基的GST[15]、具抑制作用的serine proteinase inhibitor[16]、kallikrein inhibitor[17]和抑制細菌生長發育的抗菌肽[18]。人們對蜱卵蛋白成分及其相互關系知之尚少，本研究擬以LC/MS/MS法對豪豬血蜱卵原生質中蛋白質成分進行鑒定。

豪豬血蜱廣泛分布于溫帶和亞熱帶地區，我國魯、蘇、閩、臺、粵、瓊、湘、鄂、滇、甘等地均有發現[19]，常寄生于野豬、豪豬、豬獾，偶爾也見于狗、水牛、小麂和人類[20]。該蜱攜帶錐蟲[21]、埃立克體[22]、立克次氏體[23]、包柔氏螺旋體、吉氏巴貝斯蟲[24]等多種病原微生物，并有人被叮咬后發生無形體病[25]、日本斑點熱[26]的報道，具有一定的公共衛生意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 氯仿、甲醛、乙腈、甲酸系國藥集團化學試劑有限公司產品；胰蛋白酶購于Promega(北京)生物技術有限公司；Q Exactive 質譜儀為Thermo Fisher生產；液相色譜儀購于Agilent Technologies。

1.1.2 豪豬血蜱 豪豬血蜱采自湖南省湘西豬獾體表，由湖南農業大學動物醫學院程天印教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 蜱卵的收集與處理 將飽血雌蜱置于昆蟲培養箱，于28 ℃，85%RH下培養。每日定時收集蜱卵。按徐律和程天印[27]的方法去除卵表臘質。

1.2.2 蛋白的提取與消化 取去臘質卵50 mg，加入0.1 mol·L-1Tris-HCl溶液0.4 mL，研碎；轉移至潔凈離心管，加入20%SDS和1M DTT 各25 μL， 混勻，95 ℃孵育3 min；25 ℃下，16 000g離心10 min，取上清；凍干，備用。

1.2.3 樣品處理 取卵蛋白干粉50 g，加入100 mmol·L-1DTT 50 μL，沸水浴5 min，冷卻至室溫；加入8 mol·L-1尿素緩沖液200 μL，混勻，轉入10 ku超濾離心管，14 000g離心 15 min。加入100的IAA液，混勻，14 000g離心10 min。尿素緩沖液洗滌2次。加胰蛋白酶消化液40 μL至濾膜上，600 r·min-1振蕩1 min，37 ℃ 16～18 h。14 000g離心濾液10 min，移至C18小柱，過柱脫鹽后冷凍干燥。

1.2.4 質譜分析 以0.1%三氟乙酸溶解上述肽段樣粉，自動進樣器進樣，經捕集柱、色譜柱分離后，質譜儀檢測離子。檢測方式：正離子；采集方法：每次采集10個碎片圖譜。

1.2.5 數據分析 將質譜數據和自建的褐黃血蜱卵巢轉錄組翻譯文庫(PRJNA600997)、唾液腺轉錄組翻譯文庫(PRJNA280697)和中腸轉錄組翻譯文庫(PRJNA286260)肽序列導入Mascot2.2，設定搜索參數，搜索特異性肽段及其匹配多肽。

1.2.6 蛋白序列分析 上傳各高可信蛋白序列至Uniprot數據庫，進行搜庫、注釋。

2 結 果

2.1 卵總蛋白檢測

采用BCA法測定卵蛋白粗提液濃度，提取液蛋白含量5.26 μg·μL-1。卵蛋白粗提液的SDS-PAGE結果表明，豪豬血蜱卵原生質所含蛋白多在15～170 ku，且分布不均，相對質量近55、65、80、120和170 ku者豐度尤高。

2.2 卵蛋白鑒定

以卵蛋白酶解物質譜檢測數據搜索卵巢、唾液腺、中腸轉錄組文庫，分別檢出特異性肽段359、312、357條，鑒定蛋白108、170、161種，其中高可信的(unique peptides≥2)依次為60、35、45種(圖2，有部分重疊)。基于序列比對，合并由同一mRNA編碼的，最終鑒定高可信蛋白103種，但其中36種尚無相關研究資料(表1)。

基于既有文獻，按活性或功能對本研究檢出的、有文獻參考的67種高可信蛋白進行分類，結果見表1。表1列出的67種高可信蛋白分別屬于酶類、蛋白酶抑制劑、轉運蛋白、細胞骨架蛋白、熱休克蛋白和免疫相關蛋白等6類，其中酶類最多(25種)， 其次是蛋白酶抑制劑(18種)和轉運蛋白(11種)。

M. 蛋白質相對分子質量標準；1.樣品M. Protein marker; 1. Sample圖1 豪豬血蜱卵總蛋白提取液SDS-PAGE圖Fig.1 Proteins extracted from the eggs of Haemaphysalis hystricis

OV、SG、MG分別是卵巢轉錄組文庫、唾液腺轉錄組文庫、中腸轉錄組文庫鑒定到的蛋白OV, SG and MG represent the proteins identified in ovarian transcriptome library, salivary gland transcriptome library and midgut transcriptome library respectively圖2 卵巢、唾液腺和中腸轉錄組文庫中鑒定到的高可信蛋白及其重疊情況Fig.2 Overlap of highly confidence proteins identified in the ovary, salivary glands, and midgut transcriptome libraries

2.3 103種高可信蛋白生物信息學分析

借助Omics Bean對高可信蛋白進行GO分析，結果表明(圖3)，本次鑒定的高可信蛋白多為細胞外蛋白，參與免疫調節，并且在酶活性調節方面發揮作用。

圖3 豪豬血蜱卵103種高可信蛋白GO分析結果Fig.3 GO analysis of 103 highly confident proteins in Haemaphysalis hystricis eggs

3 討 論

由于目前尚無豪豬血蜱的基因或蛋白文庫，故本研究便基于筆者構建的其近緣蜱種(褐黃血蜱)的卵巢、唾液腺和中腸轉錄組文庫進行其卵蛋白成分鑒定。與筆者所做的褐黃血蜱卵蛋白鑒定結果一致，暗示這一做法可行、可靠。在分析過程中，發現有些蛋白可從不止一個文庫搜出，為此，我們首先借助序列比對厘清它們的關系，然后進行取舍或拼接，如SG27993長149 aa，MG1301長373 aa，兩者相同部分138 aa，對其進行拼接，然后搜庫、注釋；MG4254長316 aa、OVN53697長673 aa，MG4254包含于OVN53697，故舍棄MG4254，以卵巢序列OVN53697搜庫、注釋。

從本次鑒定的高可信蛋白看，無論是酶，還是酶抑制劑和轉運蛋白都存在同一家族多個成員并存的情況，筆者稱之為家族性。在卵原生質蛋白中比較突出的是Cathepsin、Aspartic protease、Serpins 9、Kunitz、Vitellogenin、Microtubule associated complex、HSP70等。同家族蛋白在胚胎發育過程中如何協調、互補地發揮作用尚不得而知。比對顯示，同家族蛋白間的一級結構極其相似，如OVN53099和MG241(Cathepsin L-like cysteine protein)對應部分的相似性達93.16%。

組織蛋白酶類是酶類最多的，且主要是天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶兩類，其中前者14種，后者7種。業已證明，Cathepsin D、Heme-binding aspartic peptidase、Cathepsin L-like cysteine protein以及Vitellin-degrading cysteine endopeptidase均可催化卵黃蛋白和血紅蛋白水解[12-13,28-30], 但活性有所差異，如微小扇頭蜱的Cathepsin D對卵黃蛋白的活性較高[28]，Vitellin-degrading cysteine endopeptidase對血紅蛋白的活性更高[12]。

在蜱卵原生質中還存在大量的蛋白酶抑制劑，其中Serpin類數量最多，其次是Cystatin。人們已從長角血蜱、篦子硬蜱等蜱鑒定到數種Serpin[31-35]，大多數serpin既能抑制絲氨酸蛋白酶，進而影響到血紅蛋白的降解[36]，又可抑制糜蛋白酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶等，起到調節宿主免疫系統的作用[37-38]。Waxman等[39]證實，蜱類的Serpin具有抗凝活性，但機制不盡相同，如毛白鈍緣蜱的serpin抑制Xa因子，長角血蜱的serpin 2抑制凝血酶活性[40]。Cystatin是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制Cathepsin L-like cysteine protein[41]以及Vitellin-degrading cysteine endopeptidase[42]等酶的活性，暗示蜱類胚胎發育過程中發生的酶促反應也受控制、調節。

Vg是豪豬血蜱卵中的高豐度成分，種類也較多，如Vitellogenin-1、Vitellogenin-2、Vitellogenin-B 以及Vitellogenin。Vg主要由飽血雌蜱的中腸和脂肪體合成，通過淋巴轉移至卵巢，然后轉化為Vn，作為胚胎發育必須的營養貯存于卵原生質[43]。另外，本次還鑒定了6個脂蛋白和1個脂肪酸結合蛋白。Kluck等[44]證實，微小扇頭蜱血淋巴中的一種脂蛋白RmLCP可結合大多數脂肪酸，發揮運輸脂類的作用。Campos等[45]認為，脂類和碳水化合物是微小牛蜱胚胎發育的主要能源物質。此次鑒定到的葡萄糖脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、轉酮醇酶和ATP合酶等4種糖代謝相關酶的存在說明胚胎發育過程中既有糖酵解反應[46]，也有戊糖磷酸途徑[47]。

蜱卵原生質蛋白具有開發應用價值。Maria以微小扇頭蜱卵源Cathepsin免疫牛，激發了顯著的免疫應答[48]。以微小扇頭蜱卵源Vitellin-degrading enzyme免疫牛使其獲得了保護性[49]。

4 結 論

經FASP法消化豪豬血蜱卵蛋白提取物，LC/MS/MS法檢測結果顯示：搜索褐黃血蜱卵巢轉錄組文庫、唾液腺轉錄組文庫和中腸轉錄組文庫，分別檢出特異性肽段359、312、357條，鑒定多肽108、170、161條，高可信蛋白103種。豪豬血蜱蜱卵原生質中富含酶類、蛋白酶抑制劑、轉運蛋白、細胞骨架蛋白、蛋白質合成與修飾、分泌蛋白以及未鑒定的蛋白等。