水溶性烯丙孕素-磺丁基-β-環糊精包合物的制備及表征

楊玉帥，李 澤，金天明，楊 升

(天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384)

烯丙孕素又名四烯雌酮(altrenogest，ALT)，是一種人工合成的脂溶性甾體類孕激素[1-2]，化學性質不穩定，它與黃體酮、乙炔諾酮和氟孕酮等的作用相似，可單獨使用或與促性腺激素聯合使用[3-4]，均能抑制促性腺激素的釋放，抑制卵泡的生長發育和成熟[5-6]，作為同期發情的藥物，用藥結束后，母豬、母馬等動物可同期發情和排卵[7,8]，有利于養殖場批次化和規模化的進行人工授精和管理[9-11]。又由于烯丙孕素原藥不溶于水，進入動物體內不能很好得吸收利用，導致其生物利用度大大降低，不能很好地達到生產預期，也造成了藥物的浪費[11]。如今，市場上的烯丙孕素應用劑型以口服液為主[12-17]，因為其藥效時間短且經口服給藥后易產生首過效應，進而導致其有效濃度降低，不能很好的達到預期效果，且需要數日連續飼喂，連用18 d。該口服制劑需與飼料混合食用，在一定程度上很難保證用藥劑量的準確性，且該口服劑型的溶劑為有機植物油，適口性差，不易被動物接受，使用起來較為麻煩。

磺丁基-β-環糊精(SBE-β-CD)是對β-環糊精進行修飾后得到的β-環糊精衍生物，具有很好的水溶性，可與一些難溶性藥物進行包合，被包合的水難溶性藥物進入β-環糊精衍生物的空腔后，可有效提高原有藥物的穩定性，增加其水溶性[18-20]，還具有一定的藥物緩釋作用[21]，對堿、熱和光穩定，且本身無毒，安全性高[22]。

因此，通過使用SBE-β-CD對水難溶性藥物烯丙孕素進行包合，來提高烯丙孕素的溶解度；并對包合物進行了表征分析和相關性質的考察以及溶解度的測定，得到的包合物載藥體系可滿足多種劑型的要求，配制出不同的臨床使用劑型，為烯丙孕素的新藥開發以及臨床應用研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

烯丙孕素(含量99%，寧波三生藥業有限公司)、磺丁基-β-環糊精(上海旭碩生物科技有限公司)、氫氧化鈉(天津市風船化學試劑科技有限公司)、無水乙醇(天津市百世化工有限公司)、去離子水和試劑均為分析純。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)、HS-1DN磁力攪拌器[MAGNETIC STIRRER 株式會社(中國制造)]、電子分析天平(Mettler Toledo Newclassic MF MS204S Switzerland)、FTIR傅里葉紅外光譜儀(lambda scientific 天津港東科技發展股份有限公司)、TG209F3熱重分析儀(德國耐馳公司)、T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、Coolsafe 100-9 pro真空冷凍干燥機(丹麥 Labogene)、-80 ℃超低溫冰箱(Panasonic 冰山松洋生物科技(大連)有限公司)、Echo Revolve正置倒置一體熒光顯微鏡(美國Echo公司)。

1.2 方法

1.2.1 烯丙孕素標準曲線建立 精密稱取ALT原藥12.5 mg于50 mL棕色容量瓶中，用適量的50%乙醇溶液搖晃溶解并定容至刻度，配制成濃度為0.25 mg·mL-1的標準溶液；取上述溶液稀釋，配制成濃度為1、2、4、6、8、12 μg·mL-1的工作液，依照紫外分光光度法，在352 nm波長處測定其吸光度，以工作液中ALT的濃度(μg·mL-1)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，根據不同濃度ALT標準溶液的吸光度A，繪制標準曲線圖1。

圖1 烯丙孕素標準曲線Fig.1 Standard curve of altrenogest

由圖1可知，在濃度為1～12 μg·mL-1，吸光度A與濃度的線性回歸方程：y=0.089 7x+0.013 7，R2= 0.999 9。結果表明，烯丙孕素在該濃度范圍內具有良好的線性關系。

1.2.2 烯丙孕素-β-環糊精衍生物包合物的制備 參考相關文獻、根據烯丙孕素藥物及SBE-β-CD的理化性質，采用冷凍干燥法制備烯丙孕素-β-環糊精衍生物的包合物。

精密稱取適量的烯丙孕素原藥溶解于無水乙醇溶液中，搖晃使其充分溶解，避光靜置備用；按相應摩爾比稱取SBE-β-CD于燒杯中，加入一定量的去離子水在恒溫磁力攪拌器上攪拌使其完全溶解，并逐漸升溫至55 ℃，向其中緩慢加入上述所制得的烯丙孕素無水乙醇溶液，維持溫度攪拌反應4 h，之后轉至室溫避光條件下攪拌6 h，將制得的烯丙孕素包合物溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液于-80 ℃ 超低溫冰箱中預凍24～48 h，真空冷凍干燥后研磨過篩即得。

1.2.3 正交試驗 以ALT與SBE-β-CD投料摩爾比(A)、包合時間(B)、溶液pH(C)以及溶劑的體積(D)為影響因素，每個因素3個水平，采用L9(34)正交試驗法進行試驗，選擇包合物的包合率和收率為評價最優工藝指標。影響因素及水平見表1，綜合評分按收率∶包合率=0.3∶0.7的權重計算。

表1 包合物影響因素及水平

1.2.4 含量測定 準確稱取ALT-SBE-β-CD包合物12.5 mg于50 mL棕色容量瓶中，用適量50%乙醇溶液超聲溶解并定容至刻度；從中取其1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，50%乙醇溶液定容，震蕩搖勻；以50%乙醇溶液做對照，測定吸光度A，將吸光度A代入線性回歸方程計算出包合物中ALT的含量，計算包合率和載藥量，每組做3個平行。

包合率%=包合物中烯丙孕素的質量(g)/投藥量(g)×100%；

收率%=所得包合物實際質量(g)/(SBE-β-CD加入量(g)+加藥量(g))×100%；

載藥量%=包合物中烯丙孕素含量(g)/所制得的包合物質量(g)×100%。

1.2.5 最優組合包合物的制備及含量測定 按下得到的最優制備條件(“2.1”)制備包合物并測定包合物的收率，包合物中ALT的包合率以及載藥量。

1.2.6 回收率試驗 烯丙孕素標準溶液：使用1.2.1項下的0.25 mg·mL-1烯丙孕素標準溶液。

包合物樣品溶液的配制：準確稱取ALT-SBE-β-CD包合物12.5 mg于50 mL棕色容量瓶中，用適量50%乙醇溶液超聲溶解并定容至刻度，搖勻，備用。

回收率測定：分別取0.1 mL上述ALT-SBE-β-CD包合物樣品溶液置于9個10 mL棕色容量瓶中，編號1、2、3……9，向編號1～3、4～6、7～9容量瓶中分別加入0.1、0.2、0.3 mL烯丙孕素標準溶液，用50%乙醇溶液稀釋并定容至刻度。以50%乙醇溶液為空白對照，測定吸光度A，將吸光度A帶入線性回歸方程計算出包合物中ALT的含量，計算回收率。

1.2.7 專屬性試驗 精密稱取ALT原藥、SBE-β-CD12.5 mg置于50 mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶液溶解并定容;分別取其溶液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，50%乙醇溶液稀釋定容，用紫外分光光度計在352 nm處測定吸光度A。

1.2.8 穩定性試驗 精密稱取ALT-SBE-β-CD包合物12.5 mg置于50 mL棕色容量瓶中，用適量50%乙醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，靜置備用；每隔2 h取樣測定其吸光度A，連續測定12個時間點，即分別在0、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120 h時取樣測定吸光度A。

1.2.9 精密度試驗 準確吸取上述“1.2.1”項下0.25 mg·mL-1ALT標準溶液6份，測定吸光度A。

1.3 包合物表征

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜法 分別取適量ALT原藥，SBE-β-CD，ALT/SBE-β-CD物理混合物，ALT-SBE-β-CD包合物，采用KBr壓片法，在紅外光譜儀上檢測，表征，如圖2。

1.3.2 熱重分析法 取適量ALT、SBE-β-CD、ALT/SBE-β-CD物理混合物、ALT-SBE-β-CD包合物，在熱重分析儀上進行測試，測試條件：N2為保護氣，升溫速率10 ℃·min-1，測試范圍為35～800 ℃，氧化鋁坩堝，記錄TG圖譜，見圖3。

1.3.3 顯微鏡成像法 分別取ALT、SBE-β-CD、ALT/SBE-β-CD物理混合物、ALT-SBE-β-CD包合物少量于載玻片上，用藥匙將其均勻攤開，置于100倍顯微鏡下觀察，見圖4。

1.3.4 溶解度法 稱取過量的ALT原料藥、ALT-SBE-β-CD包合物于試管中，加適量的超純水制成過飽和溶液，室溫靜置24～36 h，過濾，取一定量的續濾液用超純水稀釋成適宜濃度，于352 nm處測定吸光度A，計算ALT的溶解度。

2 結 果

2.1 ALT-SBE-β-CD包合物制備的正交試驗

根據表2正交試驗結果和表3方差分析結果可得知，各因素對ALT-SBE-β-CD包合物形成的影響大小為ALT與SBE-β-CD的投料摩爾比(A)>溶劑的體積(D)>包合時間(B)>溶液pH(C)，各因素水平對試驗結果均無顯著影響，故不必再進行各因素水平間的多重比較。直觀分析表明，ALT-SBE-β-CD包合物的最佳制備工藝為A2B3C2D2，即在55 ℃條件下，ALT與SBE-β-CD的投料摩爾比為1∶6，包合時間為5 h，溶液pH為8，溶劑的量為15 mL(當以ALT投藥量為0.1 g時計)。

表2 ALT-SBE-β-CD L9(34)正交試驗結果

表3 方差分析

2.2 最優組合包合物的制備及含量測定

經測定，ALT-SBE-β-CD包合物中ALT的平均包合率為(90.90±1.80)%(n=3，)，平均載藥量為(4.30±2.30)%(n=3，4.40%、4.20%、4.31%)，包合物的收率為(93.19±1.67)%。

2.3 回收率試驗

計算測得結果ALT-SBE-β-CD包合物的平均回收率為92.75%、95.31%和97.33%，RSD分別為1.21%、0.46%和1.05%(n=3，91.23%、93.10%、93.92%；94.69%、95.68%、95.56%；95.89%、98.11%、97.99%)。

2.4 專屬性試驗

準確稱取ALT原藥固體粉末、SBE-β-CD 12.5 mg 置于50 mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶液溶解并定容;分別取其溶液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，50%乙醇溶液稀釋定容，用紫外分光光度計在352 nm處測定吸光度，ALT溶液在此波長處有很強的吸收(A=0.562)，而SBE-β-CD在此波長處吸收很小(A=0.004)，可忽略不計，故專屬性很好。

2.5 穩定性試驗

精密稱取ALT-SBE-β-CD包合物體系12.5 mg于50 mL棕色容量瓶中，用適量50%乙醇溶液超聲溶解并定容至刻度，搖勻，在室溫避光條件下靜置備用；每隔2 h取樣測定其吸光度A，連續測定12個時間點，即分別在0、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120 h取樣，測定吸光度A(A=0.386、0.389、0.388、0.391、0.390、0.395、0.389、0.384、0.381、0.383、0.384、0.380)。計算結果得出，ALT-SBE-β-CD包合物RSD=1.14%(n=12)，表明ALT包合物載藥體系穩定性較好。

2.6 精密度試驗

準確吸取上述“1.2.1”項下0.25 mg·mL-1ALT標準溶液6份，測定其吸光度A(A=0.554、0.552、0.549、0.557、0.556、0.550)，RSD=0.58%，由此可表明儀器精密度良好。

2.7 包合物表征

2.7.1 傅里葉變換紅外光譜法 由于傅里葉變換紅外光譜能對分子的化學鍵及官能團組成進行分析，且β-環糊精衍生物在400～4 000 cm-1吸收峰很強，故易掩蓋客體分子烯丙孕素的吸收峰，因此，可通過客體烯丙孕素、主體β-環糊精衍生物、烯丙孕素與β-環糊精物理混合物、包合物的紅外光譜吸收峰的變化來確定包合物的形成。如圖2，在客體ALT分子中，在1 700～1 800 cm-1內有脂環酮(四元環)羰基特征基團的微弱伸縮振動吸收，1 620～1 680和1 570 cm-1處均為碳碳雙鍵-C=C-的伸縮振動吸收，波數1 225 cm-1左右為ALT分子中叔羥基的振動吸收，而SBE-β-CD衍生物的圖譜在此波數范圍內沒有相關伸縮振動吸收；ALT/SBE-β-CD物理混合物的紅外圖譜類似于客體ALT與主體β-CD衍生物的單體圖譜的疊加；而ALT-SBE-β-CD包合物載藥體系中ALT在1 700～1 800 cm-1有脂環酮(四元環)羰基特征基團的伸縮振動吸收，1 620～1 680 和1 570 cm-1處均為-C=C-的伸縮振動吸收以及1 225 cm-1左右為ALT分子中叔羥基的振動吸收發生顯著變化，單體中峰強度較高，包合物載藥體系中該峰強度大幅度減弱或者被SBE-β-CD的圖譜掩蓋而消失；包合物中SBE-β-CD的羥基伸縮振動由3 370 cm-1左右位移到3 316 cm-1左右，且包合物載藥體系中這些峰型也發生了變化，由以上變化可知，客體分子ALT進入了主體分子β-CD衍生物的空腔中，而不是簡單的物理吸附，說明ALT與β-CD衍生物形成了包合物載藥體系。

2.7.2 熱重分析法 由圖3可知，ALT原藥在200 ℃左右和340 ℃左右分別進行了第一階段和第二階段的失重，在530 ℃左右失重完全至0；SBE-β-CD在270、320和440 ℃左右分別進行了第一階段、第二階段和第三階段的失重；ALT/SBE-β-CD物理混合物的失重曲線為ALT原藥與SBE-β-CD兩者曲線的簡單疊加，失重溫度在220 ℃左右、320 ℃ 左右和440 ℃左右；而包合物ALT-SBE-β-CD的失重曲線與SBE-β-CD的失重曲線相似，原因可能為在表征過程中取樣量較少，且載體SBE-β-CD與ALT的摩爾比較大，進而導致在圖譜中的一些峰被掩蓋，該包合物失重溫度在270 ℃左右、320 ℃左右和420 ℃左右，較ALT原藥和物理混合物的失重溫度有所提高，說明包合物ALT-SBE-β-CD的穩定性得到一定的提高，由此可進一步說明ALT-SBE-β-CD包合物的形成。

1.ALT；2.SBE-β-CD；3.ALT/SBE-β-CD物理混合物；4.ALT-SBE-β-CD包合物1.ALT; 2.SBE-β-CD; 3.ALT/SBE-β-CD physical mixture; 4.ALT-SBE-β-CD inclusion complex圖2 SBE-β-CD系統紅外掃描圖譜Fig.2 Infrared scanning atlas of SBE-β-CD system

2.7.3 顯微鏡成像法 結果分析發現，ALT原藥的顯微鏡像清晰，呈塊狀菱形結晶；SBE-β-CD均呈圓球狀，物理混合物可明顯觀察到ALT原藥晶體以及SBE-β-CD的顯微鏡像特征；而包合物的鏡像觀察不到ALT原藥和SBE-β-CD的鏡像，僅可觀察到黑色的團狀物，無明顯的塊狀結晶或圓球狀物，由此可說明包合物已經生成。

1.ALT；2.SBE-β-CD；3.ALT/SBE-β-CD物理混合物；4. ALT-SBE-β-CD包合物1. ALT;2. SBE-β-CD; 3.ALT/SBE-β-CD physical mixture; 4. ALT-SBE-β-CD inclusion complex圖3 SBE-β-CD系統熱重分析圖Fig.3 Thermogravimetric analysis diagram of SBE-β-CD system

2.7.4 溶解度法 由測得結果可知，ALT原料藥、ALT-SBE-β-CD包合物得溶解度分別為0.015 2、15.030 7 mg·mL-1，由此可見，包合物的溶解度分別為ALT原藥的988.86倍，說明原料藥ALT與SBE-β-CD形成了包合物，并且此包合物還極大地提高了原料藥ALT的溶解度。

3 討 論

SBE-β-CD是β-環糊精的多取代衍生物，本身無毒性，具有很好的水溶性[23]，可以與各種大小相符合，可與進入自身空腔的化合物分子進行包合[24]。因主體分子SBE-β-CD的空腔具有疏水性質，故客體分子的非極性越高越容易被包合，SBE-β-CD本身帶有負電荷，所以，對那些帶有正電荷或中性的客體分子較容易包合，且形成的包合物溶解度就越大[25]。難溶性藥物可以與其內部的疏水基團通過氫鍵、范德華力等結合形成穩定的包合物[26]，通過外部親水基團與水分子結合來提高水難溶性藥物的溶解度，從而增加了藥物的療效和效力(即最佳治療活性所需的劑量減少)，可使藥物在較低劑量下有效，從而降低藥物毒性[27]；此外被包合物質進入SBE-β-CD的空腔后原有的穩定性被有效提高，改變藥物固有的理化性質，可增加水難溶性藥物的生物相容性，提高藥物的水溶性[28-29]。

由試驗結果可知，ALT-SBE-β-CD包合物的最佳制備工藝：ALT與載體SBE-β-CD的投料摩爾比為1∶6，包合時間為5 h，溶液pH為8，溶劑量為15 mL (當以ALT投藥量為0.1 g計)，以此最優條件制備得到的包合物收率為(93.19±1.67)%，包合物中ALT的平均包合率為(90.90±1.80)%，ALT的平均載藥量為(4.30±2.30)%，平均回收率為(99.90±0.79)%，穩定性試驗測得RSD為0.82%(n=6)。與其他同為SBE-β-CD載體的藥物包合相關文獻相比[30-31]，該試驗中ALT包合率較高，原因其一可能與ALT本身理化性質為偏中性相關，進而有利于藥物包合的完成，提高了藥物的包合率以及載藥量；其二可能為在制備包合物過程中加入一定量的氫氧化鈉溶液，使體系帶有更多的負電荷，更有利于偏中性的ALT包合。

a.ALT; b.SBE-β-CD; c.ALT/SBE-β-CD物理混合物; d.ALT-SBE-β-CD包合物a.ALT; b. SBE-β-CD; c.ALT/ SBE-β-CD physical mixture; d. ALT-SBE-β-CD inclusion complex圖4 SBE-β-CD系統顯微鏡成像圖Fig.4 Microscopic image of the SBE-β-CD system

本試驗所得的包合物載藥體系通過紅外光譜法、熱重分析法和顯微鏡成像法對其進行了表征，由表征結果可知，ALT與SBE-β-CD發生了包合作用，可證明包合成功，并用溶解度法對原料藥ALT和包合物ALT-SBE-β-CD進行了溶解度測定，由結果可知，相對原藥ALT來說，ALT-SBE-β-CD包合物載藥體系極大的提高了原藥ALT在水中的溶解度，為ALT的開發利用拓寬了思路。

4 結 論

篩選出了ALT-SBE-β-CD包合物的最佳制備工藝，并驗證了ALT-SBE-β-CD包合物的形成，通過溶解度法比較了ALT原藥與包合物的溶解度，結果包合物中ALT溶解度大大提高，證明SBE-β-CD對ALT原藥具有良好的增溶作用，進一步表明了包合物的形成，且該制備工藝方法簡單，條件溫和，為烯丙孕素的進一步開發利用提供了一定的理論基礎。