披針葉黃華內生真菌的分離與鑒定

趙文星，吳可欣，郭梓豫，張云昊，唐麗輝，劉奕伶，莫重輝，趙寶玉，路 浩*

(1.西北農林科技大學動物醫學院，楊凌 712100； 2.青海大學農牧學院，西寧 810016)

披針葉黃華(Thermopsislanceolata)，又名“黃花苦豆”“野決明”“牧馬豆”，蒙古語 “他日巴干-希日”，為豆科(leguminoseae)野決明屬(Thermopsis)植物[1]。披針葉黃華為多年生草本植物，資源相當豐富[2-4]，廣泛分布于我國東北、華北和西北各省區[5]。披針葉黃華多生長于草原沙丘、河岸礫灘、林下灌叢，在河谷、溝渠等地也可零星生長，偶見農田及路旁，一般散生，條件合適時也能形成小群落[6,7]。該植物憑借其發達的根系、超強的抗逆性等特性，分布范圍和分布強度逐步擴大[8]，能耐-37 ℃的低溫，在東北、青藏高原等高寒地域亦可良好越冬，同時也能在退化鹽堿化的土壤中較好生長[9]。披針葉黃華可做藥用[10]，具有興奮呼吸、祛痰、止咳、止痛、抗炎等功效[11-12]。新鮮狀態下具有特殊的苦味，牲畜一般不采食，若誤食其種子或全草后則會發生慢性中毒，干枯后毒性減弱[13]。林源等[14]研究發現，引起披針葉黃華中毒的主要成分是喹諾里西啶生物堿(Quinolizidine)類[15]，其中廣泛存在的有黃花堿(Thermopsine)、金雀花堿(Cytisine)[16]等。

植物內生真菌(endophytic fungi)是指生活史部分或者全部寄存在植物體內的各個組織或者器官內，生存狀況良好，并且沒有引起任何感染的真菌[17]。這些內生真菌具有促進植物生長發育，提高植物抗逆性的作用[18]，其次生代謝產物擁有多種結構類型(如生物堿、聚酮、萜類等)[19]，有抗腫瘤、抗氧化性、抗菌等功能[20]，在醫藥、農業、環境保護等方面廣泛應用[21]。因而，植物內生真菌中的活性代謝產物為抗生素、抗癌藥物及農藥的研究與開發提供了重要研究方向，同時也具有重要的經濟價值[22]。劉建利等[23]從苦豆子植物中分離出多種內生真菌，其葉最多，莖次之，根最少，優勢菌屬為鏈格孢屬(Alternariasp.)、枝梗莖點霉屬(Dendrophomasp.)。孫璐等[24]從毛序棘豆中分離的內生真菌中莖最高，根次之，葉最少，鏈格孢屬(Alternariasp.)、鐮孢霉屬(Fusariumsp.)為優勢菌屬。但目前有關披針葉黃華內生真菌的種類及種群分布情況尚不清楚。

鑒于此，本試驗采用表面消毒法分離披針葉黃華內生真菌，運用形態學和5.8S rDNA-ITS序列分析進行內生真菌種屬鑒定，探討披針葉黃華內生真菌的種類及種群分布特點，可為披針葉黃華內生真菌次生代謝產物的開發與利用提供重要參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗所用的披針葉黃華新鮮植物樣本(包含根、莖、葉和種子)，于2020年7月在青海省湟中縣(東經101°17′18″，北緯37°16′26″，海拔3216.6 m)采集，干燥處理后，實驗室保存備用。

1.1.2 主要試劑 2%NaClO、葡萄糖(廣東光華)；無水乙醇(成都克隆)；瓊脂粉、苯酚(北京索萊寶)；氯仿(西隴科學)；中性樹膠(國藥集團)；植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根)；真菌通用引物ITS 1和ITS 4(西安熱默爾)；75%乙醇(山東安捷)；巰基乙醇；Hieff Canace?Gold高保真DNA聚合酶；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：瓊脂(20 g·L-1)，馬鈴薯(200 g·L-1)，葡萄糖(20 g·L-1)和無菌去離子水等。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養箱(中儀國科)；冷凍離心機(德國Sigma)；TG16A臺式高速離心機(上海盧湘)；BGP Power 600通用電泳儀(北京天誠)；超凈臺(蘇州凈化)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊)；PCR基因擴增儀(美國Biorad)；冰箱(TCL)；光學顯微鏡(廈門麥克奧迪)；水浴鍋(天津泰斯特)。

1.2 方法

1.2.1 植物樣品的表面消毒 首先將洗凈的披針葉黃華植物組織剪成3 cm左右的小段，用無菌去離子水浸泡2～3 h，在超凈臺中按照以下步驟進行表面消毒處理：75%乙醇消毒30 s，無菌水漂洗1 min，2%NaClO消毒2 min(NaClO為消毒作用較強的試劑，其消毒時間需要根據不同組織性質作適度調整，并通過試驗篩選出最適的消毒時間)，無菌水漂洗1 min， 重復操作4次。

1.2.2 披針葉黃華內生真菌的分離與純化 用菌絲尖端切割法[25]對披針葉黃華植物內生真菌進行分離純化，并將純化菌株培養、編號并計算分離率(isolation rate，IR)，用于判斷披針葉黃華各組織部位(根、莖、葉和種子)內生真菌浸染的程度。

1.2.3 披針葉黃華內生真菌的形態學鑒定 參考孫璐等[24]對植物內生真菌的形態學鑒定的方法，對該植物進行鑒定。

1.2.4 披針葉黃華內生真菌的基因組DNA提取與5.8S rDNA-ITS序列分析 按照植物基因組DNA提取試劑盒說明，提取分離純化的披針葉黃華菌絲DNA。然后利用PCR擴增技術對提取到的披針葉黃華內生真菌的5.8S rDNA-ITS片段進行擴增。采用20 μL反應體系：真菌通用引物ITS 1和ITS 4各1 μL，DNA模板1 μL， Hieff Canace?Gold高保真DNA聚合酶10 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，55 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸1 min，重復上述操作33次；72 ℃終延伸10 min；最后4 ℃保溫。反應結束后，將純化的產物送至楊凌奧科公司進行測序。

1.2.5 內生真菌的系統進化分析 將內生真菌對應的序列輸入NCBI的DNA數據庫進行BLAST比對，挑選出吻合度最高的序列，在MEGA 7.0軟件中構建系統發育樹(所用方法為鄰接法，自展次數為1 000次)，根據系統發育進化樹中組群親緣關系對菌株進行分類。

2 結 果

2.1 內生真菌分離

以2%NaClO的消毒時間為時間梯度，對披針葉黃華植物組織進行表面消毒，得出以下結果：披針葉黃華不同組織適宜的消毒時間有所不同，根的消毒時間主要集中在2和2.25 min；莖的消毒時間在1.50、1.75和2.00 min；葉的消毒時間在1.50、1.75和2.00 min； 種子的消毒時間在2.00和2.25 min。而印記對照平板中，消毒時間為1.00和1.25 min的均被污染；消毒時間為1.75和2.00 min的分離到的內生真菌菌落總數最多。

2.2 披針葉黃華內生真菌形態學鑒定

將純化菌珠的菌落特征與菌絲特性的觀察結果與《真菌鑒定手冊》[26]進行比較，初步鑒定試驗中從披針葉黃華各組織樣品分離出的內生真菌。

青霉屬(Penicilliumsp.)是披針葉黃華的優勢菌屬，其菌落特征為菌落形狀規則，背面黃色，表面顏色由外向里依次為白色、淡黃色、墨綠色，該菌生長速度為2.4 mm·d-1。菌絲特征為菌絲淡黃色，頂端尖細，有隔膜，分支(圖1A1、A2)；彎孢霉屬(Curvulariasp.)是生長速度最快的菌屬，其菌落特征為菌落灰綠色，邊緣呈白色毛絮狀整齊，背面墨綠色，疏松菌絲氣生生長，生長速度為17.5 mm·d-1。菌絲特征為菌絲灰綠色，分支，有隔膜(圖1B1、B2)。

A.青霉屬；B.彎孢霉屬A. Penicillium sp.; B. Curvularia sp.圖1 披針葉黃華典型內生真菌菌落及菌絲形態Fig.1 Typical colonies and mycelium morphology of endophytic fungi in Thermopsis lanceolata

2.3 內生真菌種屬鑒定

將分離到的菌株序列在NCBI的DNA數據庫中進行BLAST比對，得出的結果在《真菌鑒定手冊》中查詢從而確定種屬，具體結果如表1所示。從披針葉黃華各組織中共分離獲得29種內生真菌，分屬于7綱、9目、11科、12屬，其中6種未定屬。

表1 披針葉黃華內生真菌鑒定結果

2.4 內生真菌在不同組織分布特點

將鑒定的結果整理并計算出不同菌屬在不同組織的相對分離頻率(表2)。結果顯示，披針葉黃華內生真菌總相對分離頻率為79.31%，葉的內生真菌分離率最高(41.38%)，莖次之(37.93%)，然后為種子(13.79%)，根的最少(6.90%)。不同植物優勢菌屬亦有不同，葉內青霉屬(Penicilliumsp.)較常見；莖內鏈格孢屬(Alternariasp.)和節孢霉屬(Arthriniumsp.)較多；種子中曲霉屬(Aspergillussp.)為主；根內則僅有鐮孢霉屬(Fusariumsp.)。

2.5 披針葉黃華內生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

使用MEGA7.0軟件，將披針葉黃華內生真菌的5.8S rDNA-ITS序列構建系統進化樹，具體見圖2所示。由圖2可以看出，分離得到的29種菌株(含有 6種未命名菌株)，根據組群親緣關系可以將除去裂褶菌屬(Schizophyllumsp.)剩余的菌株，分成種群Ⅰ(自檢支持率76%)和種群Ⅱ(自檢支持率98%)。細化又可將種群Ⅰ分為種群A(自檢支持率58%)、種群B(自檢支持率100%)，將種群Ⅱ分為種群C(自檢支持率83%)和種群D(自檢支持率98%)。

圖2 基于5.8S rDNA-ITS序列由鄰近法構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with the program Neighbor-joining (NJ) based on 5.8S rDNA-ITS sequences

3 討 論

本試驗采用植物表面消毒法和PDA培養基對披針葉黃華組織樣品進行消毒，能夠確保分離到的真菌是內生真菌，但同時也可能對組織中的真菌造成一定的影響[27]。消毒過程中，時間過短會因達不到消毒目的而導致污染，消毒時間過長則影響內生真菌分離的種類和數量，由此可見篩選最佳消毒時間尤為重要[28]。本試驗將2%NaClO的消毒設定幾個時間梯度進行篩選，結果顯示，披針葉黃華根的最佳消毒時間為2 min，葉的最佳消毒時間為1.75 min，種子的最佳消毒時間為2.25 min，莖的最佳消毒時間為2 min。由此可見，同一植物不同部位的最佳消毒時間有所不同。

本試驗表明，披針葉黃華中葉的內生真菌分離率最高，莖次之，種子和根較少。這可能是因為葉較薄且相對表面積較大而最易受到浸染，而種子硬度較高、試驗中創造出的新鮮創面不足等因素造成分離率較低。關于披針葉黃華種子特性，王進等[29]研究表明，苦豆子與披針葉黃華種子的健壯度和硬實率都很高，含水量都很低且差異不顯著；同時，兩種豆類在寬度、厚度和相對密度上沒有顯著差異，故可推測兩種植物的種子特性可能差異不大。余永濤[30]等從苦豆子中共分離到27株真菌，主要分布于葉、莖部位，花中較少，而種子和根部組織中始終未分離到真菌，這與本試驗結果基本相似。另外，黃恩霞等[31]對藏沙蒿內生真菌分離過程中發現，花內分離到的真菌種類最多，其次是根，然后是莖，葉內分離率最低；而陳青青等[32]發現，在白芨各組織內生真菌的分離中根的分離率最高，莖次之，葉最低。以上結果與本試驗中披針葉黃華內生真菌分離情況有差異，由此說明不同植物受內生真菌侵染的程度也不同。

本試驗共分離出29種菌株，屬于7綱、9目、11科、12屬，其中，6株未定屬。青霉屬(Penicilliumsp.)在莖和葉中均分離出，而曲霉屬(Aspergillussp.)在莖和種子中均分離出，由此可見這兩種菌在披針葉黃華中定植比較廣泛。披針葉黃華優勢菌屬—青霉屬(Penicilliumsp.)屬于腐生類真菌，是自然界中一類重要的分解者，可以產生結構類型豐富的活性次級代謝產物，這些次級代謝產物在抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥物開發中發揮重要作用[33-34]，而莖中發現的鏈格孢菌屬(Alternariasp.)其發酵產物具有一定抗氧化和細胞毒的潛力，表明披針葉黃華內生真菌能產多種具有藥理活性的化合物[35-36]。除此之外，在披針葉黃華中分離出的諸如小雙胞腔菌屬(Didymellasp.)、蛇孢腔菌屬(Ophiobolussp.)、彎孢霉屬(Curvulariasp.)、多尾孢菌屬(Podosporasp.)等內生真菌的次生代謝產物成分及是否有藥理活性化合物還需進一步深入研究。

4 結 論

經過對披針葉黃華各組織內生真菌的分離與鑒定，共發現12屬29種內生真菌；在披針葉黃華各組織中，葉中分離到的內生菌種類最多，莖次之，之后為種子和根；披針葉黃華植株葉中的優勢菌屬為青霉屬(Penicilliumsp.)，其在葉和莖中均有分布。