金黃色葡萄球菌SSL7蛋白對補體系統的作用分析

鄧亦寧 張云科 王朋朋 田欣睿 焦曉宇 吳文學

(中國農業大學 動物醫學院，北京 100193)

在我國奶牛養殖業中，葡萄球菌性乳房炎是威脅奶牛健康的重要原因，研究表明，臨床型奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的分離率高達10.2%[1]。王英杰等[2]調查表明，S.aureus感染北京地區奶牛導致的乳房炎發病率高達71.1%，其中37.8%呈隱性感染。S.aureus表達多種毒力因子，包括腸毒素、中毒休克綜合征毒素-1(Toxic shock syndrome toxin-1, TSST-1)、超抗原蛋白(Superantigen protein)和超抗原樣蛋白(Staphylococcal superantigen-like proteins, SSLs)等。SSLs與超抗原蛋白具有高度同源性，其基本保留了超抗原蛋白的結構特征，但在功能上卻存在極大差異。Fitzgerald等[3]對8株S.aureus基因組SSLs家族的26個等位基因進行鑒定，發現共有11個獨特的SSL基因駐留在SaPIn2的19 kb區域內，SSL基因按照它們沿基因組出現的順序命名。Benson等[4]在血液培養物和喉咽拭子中隨機收集并分離了40株S.aureus，其全部被檢出了SSL基因，表明在SSLs在細菌中無冗余作用。已有多項研究確定部分SSLs的生物學特性，其功能多與免疫逃避相關。SSL3與Toll樣受體2(Toll-like receptor, TLR2)結合，通過病原體相關分子抑制TLR2的活化[5]；SSL8可以結合胞外基質蛋白粘合素C，抑制其與細胞外纖維蛋白原結合蛋白(Extracellular fibrinogen binding protein, EfB)的相互作用，減弱角質細胞的運動能力[6]；SSL5和SSL11結合表達在白細胞表面的PSGL-1(P selection glyooprotein ligand)，抑制中性粒細胞外滲[7]。

SSL7能特異性結合IgA，是SSLs家族中首個被證實的葡萄球菌免疫球蛋白結合蛋白，具有鮮明的超抗原樣特性[8]。SSL7基因位于基因島α(Genetic island-α, GIα)上，蛋白結構預測與SSL5相似。SSL7的二維氨基酸序列與TSST-1最為匹配[9]，TSST-1呈莖環結構(Stem-loop structure)，其被抗原呈遞細胞(Antigen presenting cell, APC)識別后形成MHC Ⅱ-TSST-1復合物，誘發機體產生過敏毒素，導致休克與多器官衰竭[10]。過敏毒素是具有炎癥介質作用的活性片段，包括補體活化過程中產生的C3a、C4a和C5a，其中 C5a 的作用最強，C3a 次之，C4a在人體中尚未發現的明確作用[11-12]。Motamedifa等[9]與Koch等[13]發現，注射眼鏡蛇蛇毒耗盡補體的小鼠更容易受到嚴重的葡萄球菌感染，說明補體系統可有效抑制S.aureus的定殖。而S.aureus通過進化出多種免疫逃逸機制，抑制機體補體系統的激活[14]。SSL7結合IgA的方式與金黃色葡萄球菌A蛋白 (Staphylococcal protein A，SPA)結合IgG相似，SPA的C端結合域X與細菌的細胞壁結合，N端結合域D、E、A、B結合在免疫球蛋白IgG上，不僅能阻斷Fc受體介導的吞噬作用，還能有效干預C1q的識別與結合，抑制補體的活化，提示SSL7蛋白也可能與補體系統特異性反應，阻斷補體級聯反應[15-16]。

為探究SSL7在S.aureus感染過程中的作用，本研究通過大腸桿菌表達系統表達了重組蛋白SSL7，隨后利用補體殺傷試驗、Western Blot和pull-down試驗證明重組蛋白SSL7可以通過與C5特異性結合從而抑制補體系統的激活，延長細菌在血液中的存活時間。

1 材料與試劑

1.1 菌株及載體

S.aureusNCTC 8325株，購于中國醫學細菌菌種保藏管理中心。大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)、DH5α，表達載體pET-28a(+)購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

異丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG)、鹽酸胍購自北京索萊寶科技有限公司；BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin (耐還原螯合型)試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。鼠抗His-tag mAb、山羊抗人C5 mAb、鼠抗兔C9 mAb、HRP標記山羊抗鼠IgG、HRP標記的兔抗山羊IgG購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 重組質粒的構建

2.1.1提取S.aureus全基因組DNA

取1 mLS.aureusNCTC 8325培養液，收集菌體沉淀后提取S.aureus全基因組DNA，用100 μL的ddH2O回收全基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后保存于-20 ℃冰箱備用。

2.1.2SSL7基因擴增

根據GenBank上公布的S.aureusNCTC 8325的SSL7蛋白的基因序列(Gene ID: CP000253.1)，利用軟件Primer Premier 5.0設計PCR引物SSL7-F/SSL7-R，如表1，引物由生工生物工程(北京)股份有限公司合成。

表1 本研究中的引物序列信息Table 1 Information of primer sequence in the study

反應體系：2×FastPfu高保真DNA聚合酶25 μL，上下游引物SSL7-F/SSL7-R各1 μL，DNA模板4 μL，ddH2O補至50 μL。反應結束后，通過凝膠電泳以及Nano Drop 2000微量分光光度計驗證PCR產物的大小和純度。回收擴增的DNA片段。

2.1.3重組表達載體pET-28a(+)-SSL7的構建

用限制性內切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ對回收的DNA片段及大腸桿菌表達載體pET-28(a)+進行雙酶切，設計20 μL連接體系：目的基因4 μL，表達載體pET-28(a)+ 10 μL，T4DNA 連接酶1 μL，10×T4DNA連接酶Buffer 2 μL，ddH2O 3 μL。體系置室溫連接2 h。測序正確的陽性菌落用質粒提取試劑盒抽提質粒，命名為pET-28a(+)-SSL7。

2.2 誘導表達重組蛋白SSL7

將重組質粒pET-28a(+)-SSL7轉入感受態細胞E.coliBL21(DE3)中，挑取單菌落，接種于Amp+LB液體培養基中，37 ℃ 200 r/min恒溫搖床培養，待菌體密度至OD600值為0.4～0.6時，加入IPTG至其終濃度為1 mmol/L，調整恒溫搖床參數為25 ℃，繼續培養6 h。

2.3 鑒定純化重組蛋白SSL7

收集誘導表達的菌沉，超聲破碎，收集菌沉和上清各10 μL進行SDS-PAGE電泳，通過Western Blot鑒定重組蛋白SSL7。用Ni-NTA親和層析柱純化SSL7重組蛋白，通過鹽酸胍梯度透析法復性后用Millipore超濾管(NMWL為10 ku) 透析濃縮收集液，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，同時進行SDS-PAGE檢測純化效果。

2.4 補體殺傷試驗

將E.coliDH5α菌液培養至對數生長期，收集沉淀，洗滌后重懸。進行5次10×倍比遞減稀釋，調整濃度至10-5。取新鮮兔血清(Rabbit serum, RS)，稀釋至10-4，部分56 ℃加熱30 min使補體去活化。如表2標記和加樣，37 ℃恒溫孵育1 h后涂布于Amp+ LB固體培養基上，37 ℃倒置過夜培養。記錄平板上菌落個數，根據公式計算每mL原始樣品中所含有的細菌總數。進行3組重復。

表2 補體殺傷試驗體系各成分列表Table 2 Complement killing text system μL

2.5 Western Blot檢測補體沉積

將S.aureusNCTC 8325株培養至平臺期后收集菌沉，PBS洗滌重懸，等分為4組：加1 mL無菌PBS；加入1 mL含10%兔血清的反應緩沖液；加1 mL 56 ℃加熱30 min的滅活兔血清緩沖液；加10 μL 重組蛋白SSL7和990 μL 10%兔血清的反應緩沖液。37 ℃恒溫孵育1.5 h后通過Western Blot檢測補體沉積。

2.6 Pull-down檢測重組蛋白SSL7與補體C5結合

取3 mL BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin裝柱，平衡3次。分別取20 μL的重組蛋白SSL7和20 μL的PBS與健康人血清混合，使Ni-NTA充分結合帶有His標簽的SSL7蛋白。盡可能洗去非特異結合的蛋白。加入100 μL含1×Loading Buffer的PBS，沸水煮10 min，進行SDS-PAGE 電泳。通過Western Blot檢測補體C5是否被SSL7捕獲。

2.7 數據分析

利用GroophPad Prism 8.0.2進行多重比較和方差分析(ANOVA)，并作顯著性分析。P<0.05表示存在差異顯著，P<0.01表示存在極顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 構建重組表達質粒pET-28a(+)-SSL7

以S.aureus全基因組為模板，PCR擴增SSL7基因，擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預期DNA的大小一致，沒有非特異性擴增產物。用限制性核酸內切酶Xho Ⅰ和BamH Ⅰ 雙酶切PCR產物和pET-28a(+)表達載體，電泳鑒定酶切產物，與預期相符，未出現其他非特異性酶切位點。將連接好的重組表達質粒轉化到感受態細胞E.coliDH5α，挑取菌落進行鑒定和測序，如圖1，目的片段大小為696 bp，序列和連接方向均正確，命名為pET-28a(+)-SSL7。

3.2 重組蛋白SSL7的表達與純化

3.2.1重組蛋白SSL7的表達

經IPTG誘導表達，超聲裂解后，分別取未誘導全菌蛋白、誘導全菌蛋白、超裂后上清液及沉淀進行SDS-PAGE電泳，如圖2(a)，重組蛋白SSL7能夠在BL21(DE3)中正常表達，且在上清液中大量可溶性表達，大小約為25 ku，與預測值一致。

M:DNA分子質量標準;1～3:待檢重組表達質粒;N.陰性對照M: DNA molecular quality standards; 1-3: Recombinant expression plasmid to be detected; N: Negative control圖1 重組表達質粒pET-28a(+)-SSL7的構建Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid pET-28a(+)-SSL7

3.2.2重組蛋白SSL7的鑒定與純化

SDS-PAGE電泳后的誘導后表達E.coliBL21(DE3)和上清液轉印到PVDF膜上，選用未誘導的大腸桿菌全菌蛋白為陰性對照，以鼠抗His-tag mAb為一抗，Western Blot檢測結果如圖2(b)，抗His-tag抗體能識別重組蛋白，SSL7表達正確，可進一步大量表達和純化。收集Ni-NTA親和層析柱純化的蛋白樣品，PBS緩沖液透析和超濾管濃縮后，利用SDS-PAGE電泳測定純化后蛋白的濃度。如圖2(c)，純化后的重組蛋白SSL7條帶單一，純度較高，特異性較好。

3.3 補體殺傷試驗

取出孵育好的細菌，結合顯微鏡記錄各培養皿上的有效菌，計算后結果如圖3。

計算比較可得，PBS陰性對照組，加入熱滅活兔血清的HI組和加入SSL7的實驗組中，大腸桿菌均能存活，而加入新鮮兔血清的RS組，由于血清中存在補體成分，引發級聯反應，大腸桿菌被全部殺死，無法檢出。表明SSL7能抑制宿主的補體殺傷，保障細菌存活。

3.4 Western Blot檢測補體沉積

將培育至對數生長期的S.aureus分組，加入相應試劑，混均后37 ℃反應1.5 h，Western Blot檢測結果如圖4，與加入PBS相比，加入10%兔陰性血清后S.aureus激活了血清中的補體成分，使之產生MAC沉積在菌體表面上。加熱滅活兔血清后，血清中的補體成分失活，無法產生MAC沉積。加入重組蛋白SSL7的菌體表面也沒有形成MAC沉積，可見SSL7阻斷了補體系統的激活，抑制了MAC的形成。

(a)SDS-PAGE檢測SSL7蛋白的表達.M.蛋白質分子質量標準;1.未經誘導的表達菌;2～5.經IPTG 誘導的表達菌;6:表達后超裂的上清液;7:表達后超裂的沉淀.(b)Western Blot鑒定重組蛋白SSL7: 1.未誘導的大腸桿菌全菌蛋白;2.誘導后的大腸桿菌全菌蛋;3.誘導表達后超裂獲得的上清液.(c)純化重組蛋白SSL7的SDS-PAGE鑒定:M.蛋白質分子質量標準;1.超濾濃縮液(a) SDS-PAGE detection of SSL7 protein expression. M.protein maker; 1.Uninduced expression bacteria; 2-5.Expression bacteria induced by IPTG; 6.Supernatant after hyper crack; 7.Precipitation after hyper crack. (b)Western Blot identification of the recombinant protein SSL7. 1.Uninduced E. coli whole bacteria protein; 2.Induced E. coli whole bacteria protein; 3.Supernatant obtained by hyper cleavage. (c)SDS-PAGE of purified recombinant protein SSL7. M.Protein maker; 1.Ultrafiltration concentrate圖2 重組蛋白SSL7的表達、鑒定與純化Fig.2 Expression, identification and purification of recombinant protein SSL7

ns表示無顯著性差異；**表示極顯著差異。ns represent no significant difference; ** represents extremely significant difference.圖3 SSL7阻斷鼠血清對E.coli DH5α 補體殺傷的效果比較Fig.3 Effect comparison of SSL7 blocking complement killing of E.coli DH5α by mouse serum

1.PBS孵育的S.aureus;2.兔陰性血清孵育的S.aureus;3.兔陰性血清和重組蛋白孵育的S.aureus;4.兔熱滅活血清孵育的S.aureus1.S.aureus incubated with PBS; 2.S.aureus incubated with rabbit negative serum; 3.S.aureus incubated with rabbit negative serum and recombinant protein; 4.S.aureus incubated with rabbit heat-inactivated serum圖4 Western Blot 檢測沉積于菌體表面的C9分子Fig.4 Detection of C9 molecules deposited on bacteria surface by Western Blot

3.5 Pull-down方法檢測重組蛋白SSL7與補體C5的結合

以純化后的帶有His-tag的SSL7作為誘餌，與健康人血清共孵育，以等體積的PBS作為陰性對照，利用Ni-NTA捕獲抗原-抗體復合物，通過Western Blot檢測補體C5。如圖5，共獲得了2條特異性蛋白條帶，其大小分別是115和75 ku，分別與C3裂解產物C5a和C5b對應，表明重組蛋白SSL7與補體C5特異性結合。

圖5 Pull-down 檢測SSL7與補體C5的結合Fig.5 Pull-down detection of the binding of SSL7 to complement C5

4 討 論

超抗原樣蛋白雖然與葡萄球菌TSST-1和腸毒素具有結構相似性，卻沒有以極低濃度即可引發較強免疫應答的超抗原特點，其作用機理及介導的免疫逃逸機制一直是近年來的研究熱點。Armstrong等[17]發現S.aureusNTCT8325菌株和S.aureusMu50菌株分別有14種和12種SSLs，表明不同的S.aureus菌株編碼SSLs的種類與數量不完全相同，各SSLs的結構和功能亦尚不完全明確。SSL7是一種具有標識性的SSLs，大多數有關SSL7蛋白的研究集中于對其結構的探索，Laursen等[18]通過單晶X線衍射測定了S.aureus12598株與S.aureus4227株SSL7復合物的結構，發現其C端β-grasp 結構域出現變異。Bakshi等[19]對照SSL7的結合位點，改造VHH-IgA*融合蛋白，使IgA能被SSL7成功純化。SSL7的結構與SSL5十分相似，其三維結構雖然具有超抗原分子的所有主要特征，在功能上也可與白細胞結合，卻沒有檢測到超抗原活性[20]。功能上，Langley等[21]利用臨床分離得到的兩株金黃色葡萄球菌，借助標準外周血淋巴細胞增殖試驗發現SSL7與人血清中多肽結合。Wines等[22]發現SSL7盡管與單核細胞弱結合，但其結合物在葡聚糖的存在下可被樹突狀細胞(Dendritic cells, DCs)吞噬，目前尚未明確DCs的攝取機制，重組蛋白SSL7的表達與純化為今后的機制研究奠定了基礎。不僅如此，Wines等[23]還通過分別表達人、大鼠和小鼠的IgA-Fc證實IgA CH2/CH3位點的糖基化可以抑制SSL7與IgA的相互作用，為僅使用兔血清進行功能性探索的本研究提供了新思路。

過敏毒素C5a是補體系統活化產物，是炎癥反應的重要介質和趨化因子[24]。近年來，尋找鑒定新型C5a抑制劑具有重要的臨床應用價值，金黃色葡萄球菌菌趨化抑制蛋白(Chemotaxis inhibitory ofS.aureus, CHIPS)可與C5a受體特異性結合，抑制C5a的趨化作用[25]。Dutta等[26]報道了SSLs能與細胞內絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族蛋白ERK2結合，調控細胞轉錄，在炎癥和增殖中起重要作用。C5在補體級聯反應中可被C5轉化酶(C4b2a2b或C3bBb3b)裂解形成大量C5a，SSL7與C5特異性結合，可能可以作為新型補體抑制劑，治療C5a介導的炎癥反應及自身免疫疾病。

免疫逃逸對病原菌定殖至關重要，天然免疫應答能抵御大部分金黃色葡萄球菌的感染，其高度依賴補體級聯反應和中性粒細胞介導的殺傷作用。迄今為止，許多SSLs被預測出具有補體抑制活性，本研究通過Western Blot以及Pull-down試驗證實SSL7能特異性結合C5，表明其是良好的補體激活阻斷物，對結合產物的進一步探索可能可以揭示SSLs在免疫調節過程中涉及到的互補或協同功能。

5 結 論

本研究制備的重組蛋白SSL7能通過特異性結合補體C5來阻斷補體級聯反應，具有抑制宿主先天免疫反應的生物學特征，為進一步研究SSL7的蛋白結構、作用機制，探索金黃色葡萄球菌免疫逃逸機理、尋找補體新型抑制劑奠定基礎。