銀耳孢子凝固型酸奶制備工藝

朱涵予，陳政

（衡陽師范學院 生命科學與環境學院，湖南 衡陽 421000）

銀耳是一類具有保健功能的食用菌，富含多糖、蛋白質、黃酮類和多種維生素等營養物質，具有極高的食用、藥用及經濟價值[1]。銀耳孢子較銀耳子實體相比有生長周期短、易培養、耐貯存等優勢[2]。銀耳孢子發酵液中的孢子多糖含量是銀耳子實體的7～8倍，且與銀耳多糖的結構相似，功能相近，具有增強腸道消化能力、降低血脂、抗衰老與抗氧化、降低血糖等功效[3-4]。目前已有以多種銀耳子實體為原料的食品得到開發，如銀耳酸奶[5-6]、銀耳露酒[7]、銀耳豆奶[8]，而對銀耳孢子相關的應用較少。

酸奶是一類以牛奶為主要原料，經乳酸菌發酵而成的一類富含多種營養物質、芳香物質的飲品，在調節腸道環境、提供營養以及促進人體健康等方面都起著重要的作用[9]。目前我國所研發的酸奶功能和種類都較單一[10]，且銀耳相關酸奶產品主要以銀耳子實體為原料[6]，銀耳孢子酸奶在市場上還未有產品。因此，本課題將銀耳孢子作為原料添加入牛奶，經保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵制成銀耳孢子酸奶，并從銀耳孢子添加量、蔗糖添加量、乳酸菌發酵劑接種量、發酵等方面探究銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝，為酸奶口味多樣化和實際生產提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

銀耳孢子菌種：Y13，保存于華中農業大學食品科學微生物實驗室；全脂奶粉、脫脂奶粉：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；白砂糖：長沙市湘特食品有限公司；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌：丹尼斯克（中國）公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養基、MRS培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；淀粉酶（酶活力≥1.5 U·mg－1）：河南萬邦有限公司；氯化鈉、氨水、無水乙醇、無水乙醚、石油醚、剛果紅、鹽酸、碘、氫氧化鈉、乙醚、七水硫酸鈷、酚酞、三氯甲烷、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、對硝基苯酚、乙酸鈉、無水乙酸鈉、乙酸、甲醛、乙酰丙酮：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

SW-CJ-ID型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；THZ-C-1冷凍恒溫振蕩儀：太倉市實驗設備廠；MJX-280型恒溫培養箱：金壇市安普實驗儀器廠；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司；DHG-9240型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；C21-WK2102型多功能電磁爐：上海一恒科學儀器有限公司；722S型可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；AN168型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

銀耳孢子發酵液→水、全脂乳粉、蔗糖混合滅菌冷卻接種灌裝發酵→后熟成品

操作要點

（1）銀耳孢子培養：保存的銀耳芽孢菌種接種至PDA培養基上培養3 d，挑取活化的銀耳孢子接入PDB培養基中，25℃，115 r·min－1搖床培養4 d得到銀耳孢子發酵液。待搖床培養完成后用血球計數板計數并稀釋至1×108CFU·mL－1，并置于121℃滅菌15 min，于4℃冰箱中冷藏備用。

（2）酸奶制作：將水倒入鍋中煮沸，加入全脂奶粉和白砂糖混合，向牛乳中加入銀耳孢子發酵液混勻并用紗布進行過濾，再次加熱至95℃，維持10 min。待混合液冷卻至42℃左右，接入乳酸菌發酵劑，攪拌均勻后灌裝到已滅菌酸奶玻璃瓶中，于42℃恒溫培養箱發酵至成熟，放入4℃后熟。

1.2.2 實驗設計

（1）單因素實驗

①銀耳孢子添加量的確定：在蔗糖添加量6%，發酵劑接種量0.1%，發酵溫度42℃，發酵時間9 h的條件下，將樣品分成5組，其中每組3個平行試驗。改變銀耳孢子的添加量，在5組樣品中分別添加8%，12%，16%，20%，24%的銀耳孢子，研究銀耳孢子添加量對銀耳孢子酸奶感官品質的影響。

②發酵劑接種量的確定：在蔗糖添加量6%，銀耳孢子添加量16%，發酵溫度42℃，發酵時間9 h的條件下，將樣品分5組，其中每組3個平行試驗。改變發酵劑接種量，在5組樣品中分別添加0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%的乳酸菌發酵劑，研究發酵劑接種量對銀耳孢子酸奶感官品質的影響。

③蔗糖添加量的確定：在銀耳孢子添加量16%，發酵劑接種量0.1%，發酵溫度42℃，發酵時間9 h的條件下，將樣品分成5組，其中每組3個平行試驗。改變糖添加量，在5組樣品中分別添加5%，6%，7%，8%，9%的蔗糖，研究蔗糖添加量對銀耳孢子酸奶品質的影響。

④發酵時間的確定：在蔗糖添加量6%，銀耳孢子添加量16%，發酵劑接種量0.1%，發酵溫度42℃的條件下，將樣品分5組，其中每組3個平行試驗。改變發酵時間，5組樣品的發酵時間分別是8，9，10，11，12 h，研究發酵時間對銀耳孢子酸奶品質的影響。

（2）正交試驗設計

根據單因素試驗結果，將溫度控制在42℃，以銀耳孢子添加量、乳酸菌發酵劑接種量、蔗糖添加量、發酵時間作為影響銀耳孢子酸奶品質的主要因素。在每個因素中分別選出3個較好的水平進行正交試驗中。

1.2.3 質量評價

（1）感官評定標準

請10位具有相關經驗的感官評定員從色澤、氣味、滋味、組織狀態、凝乳狀態5個方面對銀耳孢子酸奶成品進行感官分析。所得結果為每項分值之和，感官評定標準如表1，感官評定表滿分為100分。

表1 感官評定標準

（2）酸奶質量指標的測定方法

①脂肪含量測定

采用索氏抽提法測定酸奶中脂肪含量。取充分混勻酸奶樣品10 g于抽脂瓶中，加入質量分數為25%氨水2 mL，混勻后置于65℃的水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫，期間不時取出振蕩。用乙醚提取酸奶樣品中的脂肪后，置于沸水浴蒸發去除乙醚，直至恒重并稱重。每組計數3次，取平均值。

②蛋白質含量測定

依次精密吸取0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL氨氮標準使用溶液，分別置于10 mL比色管中。各加入乙酸鈉-乙酸緩沖溶液4 mL及顯色劑4 mL，加水稀釋至刻度，混勻，置于100℃水浴中加熱15 min。取出冷卻至室溫。將第一瓶作為空白對照，在400 nm波長處測其吸光度值。以酸奶質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。取1 g酸奶樣品按照以上方法測定吸光值，重復3次取平均值。

③酸度測定

準確稱取4 g酸奶樣品于250 mL錐形瓶中，加入96 mL蒸餾水使酸奶樣品溶解，攪拌，靜置20 min。以酚酞作為指示劑，用0.1 mol·L-1NaOH溶液滴定，直至5 s內顏色不消退，整個滴定過程應在45 s內完成。每組計數3次，取平均值。

④乳酸菌計數

稱取酸奶樣品25 g，置于無菌均質杯中，加入無菌生理鹽水225 mL，振搖混勻并進行梯度稀釋，選擇2~3個適宜的稀釋度，各取勻液1 mL加入到無菌培養皿內，涂布至MRS培養基，于37℃培養1~2 d。每組計數3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 銀耳孢子添加量對酸奶感官評定的影響

在酸奶中添加銀耳孢子，增加酸奶的營養價值的同時也影響著酸奶的風味和組織狀態，對酸奶的品質有著重要的影響。銀耳孢子的添加量對酸奶感官評定的影響如表2。從表2中可以看出，酸奶的感官品質呈先上升后下降的趨勢，隨著銀耳孢子添加量的增加，銀耳的風味越來越濃郁。當銀耳孢子添加量為16%時，酸奶的感官評分達86分，感官品質最好，銀耳的風味較適宜，具有較明顯的銀耳清香味，且組織結構和凝固狀態都較好，表面均勻、光滑，無明顯的乳清析出。當銀耳添加量為8%時，感官評分較低，銀耳的風味較淡，幾乎嘗不出銀耳滋味，但奶味較濃，組織狀態較好。當銀耳添加量為12%時，可以嘗出少許銀耳滋味，但口感和氣味都不如銀耳孢子添加量為16%的酸奶好，此時銀耳孢子酸奶的感官評分為82分。而銀耳孢子添加量為20%時，銀耳味較濃，且組織狀態和凝固狀態都略遜于銀耳孢子添加量為16%的酸奶。當銀耳孢子添加量為24%時，銀耳孢子酸奶的感官評分低至78.3分，此時酸奶的銀耳滋味過濃，風味較差，且組織松散，凝固性差。

表2 不同銀耳孢子添加量對酸奶感官評定的影響

2.2 發酵劑接種量對酸奶感官評價的影響

發酵劑接種量在一定程度上影響著酸奶的品質。過大的接種量可能會導致發酵過快，使成品酸味過重，且可能會使乳清析出，使酸奶凝固性和組織狀態較差，所以接種量對酸奶的品質有重要影響。不同的接種量對酸奶的影響見表3。從表3中可以看出，當接種量為0.05%時，酸奶的凝固性和組織狀態都較差，風味較淡。當接種量為0.25%時，酸奶的凝固性和組織狀態都較差，滋味過酸，且有少量的乳清析出。當接種量在0.1%~0.2%之間時，酸奶的風味、組織狀態和凝固性都較好。其中接種量為0.1%時，酸奶的感官品質達到最佳，感官評分高達90.3分。

表3 不同發酵劑接種量對酸奶感官評價的影響

2.3 蔗糖添加量對酸奶感官評價的影響

不同的蔗糖添加量對酸奶感官評定的影響如表4所示。從表4中可以看出，當蔗糖的添加量未超過8%時，酸奶的感官品質差別不大。當蔗糖的添加量達到9%時，酸奶的感官評分為80.5分，酸奶的感官品質下降明顯。蔗糖的添加量為5%時，銀耳孢子酸奶的氣味較淡，口感較差。當添加量為6%時，酸奶偏酸。7%的蔗糖添加量，酸奶的感官評分達89.1分，酸甜比較適宜，口感較好。蔗糖的添加量為8%時，酸奶偏甜，口感較好。蔗糖的添加量為9%時，甜味過重，口感和組織狀態都較差。

表4 不同蔗糖添加量對酸奶感官評價的影響

2.4 發酵時間對酸奶感官評價的影響

發酵時間的長短對酸奶感官評定的影響如表5所示，隨著發酵時間的延長，酸奶的感官品質呈先上升后下降的趨勢。其中發酵9 h的酸奶，酸奶的感官評分達86分，此時的酸奶凝固性較好，無乳清析出且滋味酸甜適宜。當發酵時間為8 h時，發酵時間較短，風味較淡，凝乳狀態較差，但無明顯的乳清析出。當發酵時間達到12 h時，酸奶的感官評分低至76.3分，發酵時間過長，酸乳滋味過濃，且乳清析出嚴重，感官品質較差。

表5 不同發酵時間對酸奶感官評價的影響

2.5 正交試驗

為了更好確定銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝，本實驗采用正交試驗的方法。選擇銀耳孢子發酵液添加量、發酵劑接種量、蔗糖添加量、發酵時間4個因素作為影響因素。根據單因素試驗，從各因素中選出3個較好的水平做正交試驗。三因素三水平正交試驗見表6。

表6 正交試驗的因素和水平

根據以上選定的因素和水平進行L9(34)正交試驗，結果如表7所示。從表7中可以得出銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝為A2B2C3D1，根據極差值R得出各影響因素的影響順序應為A＞C＞D＞B，即銀耳孢子發酵液添加量＞蔗糖的添加量＞發酵時間＞發酵劑接種量。由此可見銀耳孢子的添加量對酸奶感官品質的影響最大，其次是糖的添加量。發酵劑的接種量和發酵時間的長短相對來說對酸奶的感官品質影響較小。因此可以確定銀耳孢子酸奶的最佳工藝條件為在發酵溫度為42℃的條件下，添加8%的蔗糖，16%的銀耳孢子，接入0.15%的乳酸菌發酵劑，經9 h發酵制成的銀耳孢子酸奶感官品質最佳。

表7 L 9(34)正交試驗數據

2.6 酸奶質量指標

我們根據正交試驗結果所得的最佳工藝進行酸奶的制備，并進行酸奶相關質量指標的測定。測得的銀耳孢子酸奶的脂肪含量為2.7 g·100 g－1；蛋白質含量為2.45 g·100 g－1；酸度為79°T；乳酸菌數為3.49×107CFU·g-1。根據GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》中所規定的標準，要求脂肪含量為≥2.5 g·100 g－1，蛋白質含量≥2.3 g·100 g－1，酸度≥70.0°T，乳酸菌數≥1×106CFU·g－1。上述結果顯示，銀耳孢子酸奶的各項理化指標及微生物指標均符合GB 19302—2010規定的要求[9]，為合格的產品（見表8）。

表8 理化指標與微生物指標

3 結論

本實驗以銀耳孢子和牛奶為原料，選用嗜熱乳酸鏈球菌和保加利亞乳桿菌1:1混合菌種作為乳酸菌發酵劑。實驗通過單因素試驗對影響酸奶品質的4個主要因素：銀耳孢子的添加量、蔗糖添加量、發酵劑接種量、發酵時間進行了探究。

（1）在研究不同銀耳孢子添加量對銀耳孢子酸奶感官評定的影響時，得出當銀耳孢子添加量為16%時酸奶的感官品質最佳。銀耳添加量為8%和12%時，銀耳的風味較淡，而銀耳孢子添加量為20%和24%時，銀耳味都較濃，口感和氣味都不如銀耳孢子添加量為16%的酸奶。

（2）在研究不同的發酵劑接種量對酸奶感官評價的影響時發現，當接種量在0.1%~0.2%之間時，酸奶的風味、組織狀態和凝固性都較好。其中接種量為0.1%時，酸奶的感官品質達到最佳。當接種量為0.05%和0.25%時，酸奶的組織狀態和凝固性都較差。

（3）在研究不同蔗糖添加量對酸奶感官評價的影響時發現，當蔗糖的添加量未超過8%時，酸奶的感官品質差別不大。當蔗糖的添加量達到9%時，酸奶的感官品質下降明顯。蔗糖的添加量為5%時，銀耳孢子酸奶的氣味較淡，口感較差。當添加量為6%時，酸奶偏酸，口感一般。7%的蔗糖添加量，酸甜比較適宜，口感較好。蔗糖的添加量為8%時，酸奶偏甜，口感較好。蔗糖的添加量為9%時，甜味過重，口感和組織狀態都較差。

（4）在研究發酵時間的長短對酸奶感官評價的影響時發現，發酵9 h的酸奶，凝固性較好，且無乳清析出，滋味酸甜適宜。當發酵時間為8 h時，因發酵時間較短，風味較淡，凝乳狀態較差，但無明顯的乳清析出。當發酵時間達到12 h時，發酵時間過長，酸乳滋味過濃，且乳清析出嚴重，感官品質較差。

（5）本實驗通過正交試驗確定了銀耳孢子酸奶的最佳制作工藝，研究表明當糖添加量為8%，銀耳孢子添加量為16%，發酵劑接種量為0.15%，發酵溫度為42℃，發酵時間為9 h時，銀耳孢子酸奶的感官品質最佳。且經檢測，銀耳孢子酸奶的脂肪含量為2.7 g·100 g-1；蛋白質含量為2.45 g·100 g-1；酸度79°T；乳酸菌數達到3.49×107CFU·g-1，均符合國家標準。銀耳孢子酸奶同時具有銀耳和酸奶的營養和保健功能，銀耳和牛乳達到營養互補，提高了產品的營養價值[11]。本實驗為銀耳孢子風味酸奶的研制提供了理論依據，豐富了功能性酸奶的種類，具有較好的市場前景。