四種典型新疆奶疙瘩細菌多樣性與氣味特征探究

王進，張晶晶,2,3，李曉晨，寧喜斌,2,3，羅磊，蔣敏，李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品及加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)

奶疙瘩是新疆哈薩克族的傳統乳品，由牛奶或羊(馬)奶自然發酵后去水干燥而成，按制作工藝分可分為酸凝和酶凝兩種，其氣味獨特、工藝簡單且富含多種營養[1-2]。我國傳統奶酪乳酸菌種類多樣，已分離出植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)等具有良好益生特性和風味特征的菌株[3-7]。ZHENG等[8]對新疆哈薩克族傳統奶酪研究，發現乳桿菌屬(Lactobacillus)與乙醇、丁酸、乙酸和丙氨酸相關；鏈球菌屬(Streptococcus)主要為乙偶姻、乳酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯的貢獻菌屬。GUARRASI等[9]對2種發酵型乳酸菌和9種非發酵乳酸菌產風味化合物研究發現，乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)和 2-丁醇、丁酸、己酸及其相應的酯類物質有關；干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌主要產2,3-丁二酮、2-羥基-丁酮。除乳酸菌之外，乳制品中其他細菌如丙酸桿菌、腸桿菌、無氧芽胞桿菌屬和酵母菌等也有助于風味和色澤的形成。目前，對于新疆不同原料奶疙瘩細菌多樣性與氣味特征的探究鮮有報道。

近年來，以Miseq為代表的第二代高通量測序技術具有通量高、取樣量少和操作簡單等優點，可對樣品中不同微生物種群組成進行快速分析。固相微萃取-氣相色譜-質譜(solid-phase microextraction-GC-MS，SPME-GC-MS)聯用技術通常用來檢測不同樣品中揮發性物質，目前高通量測序結合SPME-GC-MS已廣泛應用于奶酪[10-11]、發酵肉制品[12]、酒醅[13]、腌制品[14]等微生物群落多樣性和揮發性物質的研究。本研究對新疆地區牛奶疙瘩、酸奶疙瘩和羊奶疙瘩樣品，采用Miseq高通量測序技術分析其細菌群落，同時結合SPME-GC-MS分析不同奶疙瘩的揮發性物質差異，以期為后續挖掘奶疙瘩的優良菌種資源和提升奶疙瘩風味提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶疙瘩樣品于2019年3月和6月采集自新疆地區。每種奶疙瘩各采集10份，編號為牛奶疙瘩(NNL_1)、牛奶疙瘩(NNL_2)、羊奶疙瘩(YNL)和酸奶疙瘩(SNGD)。樣品見圖1。

主要試劑有TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TM DNA Marker，大連寶生物有限公司；蛋白酶K，Merck集團；溶菌酶，Sigma集團。

1.2 儀器與設備

Illumina Miseq高通量測序平臺，美國Illumina公司；R930機架式服務器，美國DELL公司；電子秤，永康市艾瑞貿易有限公司；7890-5977A氣相色譜質譜聯用儀，美國 Agilent 公司；探頭PT100，東陽市三星溫度儀表有限公司；手動SPME進樣器、萃取纖維頭50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，美國Supelco公司；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌，鞏義予華儀器有限責任公司；DEN-400拍打式均質機，北京德世科技有限公司。

A-牛奶疙瘩(NNL_1);B-牛奶疙瘩(NNL_2); C-羊奶疙瘩(YNL);D-酸奶疙瘩(SNGD)圖1 新疆奶疙瘩樣品Fig.1 Samples of Xinjiang cheese

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌群落的高通量測序分析

參考尚雪嬌等[15]的方法并做調整。每種樣品分別取10份混勻后，使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取樣品細菌DNA。共計4個DNA樣本送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，采用338F-806R引物擴增16S rDNA V3～V4區進行高通量測序分析。采用QIIME軟件平臺調用UPARSE進行兩步對序列用于操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)進行分析，確定細菌OTU代表性序列的微生物分類水平并統計每個樣本的群落組成、結構和組間差異的統計學和可視化分析。

1.3.2 奶疙瘩的SPME-GC-MS檢測

樣品的前處理：參考鄭曉吉等[16]的方法并做調整。每種樣品分別取10份混勻后，稱取3種樣品各25 g加入無菌均質袋(20 cm×27 cm)中，加入無菌生理鹽水225 mL，均質3 min。稱取樣液15 g放于樣品瓶中(27.5 mm×95 mm)，加蓋密封60 ℃水浴平衡10 min，吸附提取50 min。結束后將SPME纖維插入GC進樣口解吸5 min，檢測揮發性組分。

GC-MS條件：起始溫度30 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至120 ℃，以15 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。進樣口溫度為250 ℃。離子源溫度230 ℃，質譜掃描范圍為50～350m/z。

實驗數據經計算機檢索與NIST11庫對照進行組分鑒定，對匹配度>800的物質予以分析。采用峰面積歸一法確定揮發性組分的相對含量。

1.4 數據分析

采用上海美吉生物云平臺、IBM SPSS Statistics 20軟件對數據進行處理和Pearson相關性分析，采用Origin 6.0軟件制圖和Cytoscape軟件進行網絡可視化制圖。

相對氣味活度值(relative odor activity value,ROAV)的計算[17]：通常選閾值較低，但百分含量較高的化合物組分，首先定義對樣品貢獻最大的組分為ROAVmax=100，其他香氣組分則按公式(1)計算：

(1)

式中：Ci和Ti分別為各揮發性物質的相對含量(%)和相對應的感覺閾值(μg/L)；Cmax和Tmax分別為對樣品總體氣味貢獻最大組分的相對含量(%)和相對應的感覺閾值(μg/L)。所有組分ROAV≤100，而且ROAV越大的組分對樣品總體氣味的貢獻也就越大。所有物質的計算結果需要滿足0≤ROAV≤100，一般把ROAV≥1的化合物作為主要的貢獻組分，0.1≤ROAV<1的組分對所測樣品的總體氣味具有重要修飾作用。

2 結果與分析

2.1 新疆奶疙瘩的細菌多樣性分析

2.1.1 α多樣性指數分析

本研究共采集了4種新疆奶疙瘩樣品，對其進行高通量測序，根據微生物多樣性分析結果，選取菌群差異較大的3個樣品進行揮發性物質分析。

對不同樣品在97%一致性閾值下的α多樣性指數進行統計，結果見表1。所有樣品的Coverage指數均>0.99，說明測序結果可信。SNGD的Shannon指數和Chao1指數均最高，其物種豐富度和群落多樣性水平相對較高。

2.1.2 屬水平群落結構分析

由圖2可知，在屬水平上NNL_1的主要群落組成為：Lactobacillus(16.03%)，Streptococcus(15.25%)，Lactococcus(乳球菌屬，6.14%)，Kurthia(庫特氏菌屬，9.80%)，Enterococcus(腸球菌屬，7.55%)，Leuconostoc(明串珠菌屬，6.99%)，norank_f__Muribaculaceae(6.97%)和Klebsiella(克雷伯氏菌屬，3.86%)。NNL_2主要群落組成為：Streptococcus(52.55%)，Lactococcus(13.30%)，Anoxybacillus(厭氧芽孢桿菌屬，17.12%)，Thermus(棲熱菌屬，6.19%)。YNL的主要群落組成為：Streptococcus(58.20%)，Lactobacillus(13.97%)，Lactococcus(18.05%)。SNGD主要群落組成為：Acetobacter(醋酸桿菌屬，22.78%)，Lactobacillus(9.95%)，norank_f__Muribaculaceae(9.1%)，Rhodococcus(紅球菌屬)和Acinetobacter(不動桿菌屬)占比在4%～5%，Bacteroides(擬桿菌屬)、Brevundimonas(短波單胞菌屬)、Gluconobacter(葡糖桿菌屬)和Arthrobacter(節桿菌屬)占比都在2%～3%。

表1 新疆奶疙瘩中細菌α多樣性Table 1 α Diversity indexes of bacterial communities in Xinjiang cheeses

圖2 新疆奶疙瘩中屬水平分布柱狀圖Fig.2 Relative abundances of bacterial communities at the genus level in Xinjiang cheeses

2.2 新疆奶疙瘩樣品揮發性物質分析

新疆奶疙瘩中主要揮發性物質包括酯類、醇類、酮類、醛類、酸類和其他類共8大類，總計68種。結果見表2。癸酸乙酯為3種奶疙瘩樣品共有組分(ROAVmax=100)。癸醛為3種不同原料奶疙瘩中共有的關鍵揮發性物質(ROAV>1)。丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和2-十一酮對牛奶疙瘩(NNL_1)香氣起重要修飾作用(0.1≤ROAV<1)；丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯為羊奶疙瘩(YNL)中關鍵揮發性物質(ROAV>1)；辛酸乙酯、庚醛、壬醛、3-甲基丁醛和1-辛烯-3-醇對羊奶疙瘩氣味起重要修飾作用(0.1≤ROAV<1)；丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯、壬醛、1-辛烯-3-醇和3-甲基丁醇對酸奶疙瘩(SNGD)香氣起重要修飾作用(0.1≤ROAV<1)。

奶疙瘩中酯類化合物主要有乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯等，與李露等[18]對新疆奶疙瘩揮發性研究結果較一致。這類C2～C8酯類化合物大多揮發性較強，閾值較低，能夠賦予奶酪甜味、水果味及花香味，而且能夠很好地掩蓋奶酪中脂肪酸和胺類物質所產生不愉快的氣味。3種共有醛類化合物為庚醛、壬醛、癸醛。庚醛賦予奶疙瘩水果味；癸醛賦予奶疙瘩油脂味和青草味；壬醛賦予奶疙瘩脂肪味。醛類化合物的形成途徑通過脂肪酸代謝、氨基酸轉氨基作用或Strecker降解，易被還原成相應的醇，因此在奶酪中含量較少。

醇類化合物的形成主要通過甲基酮和醛類還原、乳糖代謝、氨基酸代謝以及脂肪酸的降解。3-甲基丁醇是由奶酪成熟過程中蛋白質分解形成的亮氨酸通過Strecker降解，經轉氨、脫羧、還原形成具有花香味和酒香味。苯乙醇是由苯丙氨酸經酵母菌代謝形成具有玫瑰花香味，僅在SNGD樣品中被檢出，可能與奶疙瘩發酵制作時酵母菌的作用有關。

2.3 微生物與揮發性物質的關系分析

通過計算豐度前7的優勢菌屬和ROAV≥0.01的揮發性物質相對含量之間的Pearson相關系數，選取相關性顯著(P<0.05)的部分，構建了7個菌屬與11種揮發性物質的相關網絡圖，如圖3所示。Streptococcus、Lactobacillus和Lactococcus在牛奶疙瘩和羊奶疙瘩中占比較高，與癸酸乙酯、己酸乙酯和2-十一酮呈正相關。Acetobacter在酸奶疙瘩中占比最高，與壬醛、癸醛和1-辛烯-3-醇呈正相關，與2-十一酮、癸酸乙酯、己酸乙酯呈負相關，是造成酸奶疙瘩的風味與其他奶疙瘩的風味差異明顯的原因。Streptococcus和Lactococcus與3-甲基丁醛呈正相關。Kurthia、Enterococcus、Leuconostoc等非發酵型細菌與辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚醛、癸酸和2-十一酮正相關，參與了奶酪成熟過程中風味的形成。

表2 三種新疆奶疙瘩中揮發性物質Table 2 Volatile compounds in three Xinjiang cheeses

續表2

序號中文名稱氣味描述[19-21]閾值[22-25]/(μg·L-1)NNL_1YNLSNGD相對含量/%ROAV相對含量/%ROAV相對含量/%ROAV62苯乙烯—— — —0.46 —631,3,5-環戊二烯——0.54 ———64對二甲苯堅果味4 900——0.33 <0.01 0.16 <0.01 65丁基羥基甲苯杏仁味,苦澀味0.17 —10.70 —1.83 —661,2,4-三甲基苯——2.08 —1.47 —67甲基4,6-癸二烯基醚————0.21 —683-叔丁基-4-羥基苯甲醚——1.19 ———

圖3 新疆奶疙瘩中優勢細菌屬與揮發性物質相關性分析Fig.3 Correlation network analysis between dominant bacterial communities and key volatile compounds in Xinjiang cheeses注：綠色和黃色節點分布代表微生物和風味物質；節點間連線 的顏色深淺表示兩者Pearson相關系數的大小，紅色線表示正相關， 藍色表示負相關

3 結論

本研究應用Illumina Miseq高通量測序平臺對4個奶疙瘩樣品中的細菌多樣性進行測序，4個奶疙瘩樣品中牛奶疙瘩和羊奶疙瘩中主要優勢菌屬為乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬，酸奶疙瘩中主要優勢菌屬為醋酸桿菌屬和乳桿菌屬。利用SPME-GC-MS聯用技術鑒定出奶疙瘩的揮發性物質共有酯類、醇類、酮類等化合物68種。牛奶疙瘩中以酯類和酮類化合物為主，具有酒香味、果香味和青草味；羊奶疙瘩中以酯類和芳香及雜環類化合物為主，具有酒香味、果香味、甜香味和青草味；酸奶疙瘩中以酯類化合物為主，具有酒香味、果香味、青草味和奶香味。乳桿菌屬、鏈球菌屬和醋酸桿菌屬等可能影響奶疙瘩中酯類、酸類和醛類化合物含量，從而影響奶疙瘩的整體氣味。本研究為深入了解奶疙瘩中優勢細菌種群結構，發掘傳統奶疙瘩中的優良乳酸菌資源、開發奶疙瘩發酵劑提供參考。