熒光微球免疫層析方法定量檢測水產(chǎn)品中 4 種硝基呋喃代謝物

吳 爍，張 彪，張萬利，邵靜梅，劉飄雪，生 威

（食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實驗室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

硝基呋喃類獸藥是合成廣譜抗菌劑，該類藥物能抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌及原蟲等病原體的活性，因而被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療疾病[1-3]。同時，硝基呋喃類藥物還被應(yīng)用于家禽及畜牧業(yè)、蜜蜂及水產(chǎn)養(yǎng)殖中[4]，其作為飼料添加劑、生長促進(jìn)劑。戴欣等[5]發(fā)現(xiàn)，高劑量或長期對動物使用硝基呋喃類獸藥，可產(chǎn)生毒性作用，可誘導(dǎo)突變，甚至致畸、致癌。這些藥物的代謝物被人體吸收后會對人體健康造成巨大危害[6-7]。 因此，各國都對硝基呋喃類獸藥作出限量規(guī)定。2019年歐盟規(guī)定在可食用性食品中，硝基呋喃代謝物的最低殘留限量為0.5 μg/kg[8]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2020年1月6日發(fā)布的第250號公告，明確規(guī)定在動物飼養(yǎng)過程中禁止使用硝基呋喃類藥物，并且在動物性食品中不得檢出[9]。

硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝迅速，但其代謝物1-氨基-乙內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin，AHD）、5-嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮（5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）、3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）、氨基脲（semicarbazide，SEM）與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的蛋白結(jié)合物，可在生物組織中停留高達(dá)8 周[10]。對硝基呋喃類獸藥的檢測主要有高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-15]、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-18]等分析方法，其具有較高的靈敏度及準(zhǔn)確性，但是需要專業(yè)人員操作，費(fèi)時費(fèi)力，成本高，通常用于驗證性實驗。酶聯(lián)免疫吸附測試（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 法[19-21]、熒光免疫分析法[22-23]、化學(xué)發(fā)光法[24-26]、免疫層析法[27-32]等免疫分析方法，依靠抗原抗體的特異性結(jié)合，具有靈敏度高、特異性好、成本低、操作簡單快速等優(yōu)點(diǎn)。特別是免疫層析法，適用于現(xiàn)場快速檢測大量樣品獸藥殘留，是目前最普遍應(yīng)用的方法。

本研究基于抗原抗體的特異性結(jié)合作用，根據(jù)T線熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity of T line，F(xiàn)IT）與目標(biāo)物濃度間關(guān)系，建立新型熒光微球免疫層析方法（fluorescent microspheres immunochromatographic assays，F(xiàn)MICA），制備熒光微球抗體偶聯(lián)標(biāo)記物（fluorescent microspheres antibody conjugated markers，F(xiàn)Ms-Ab）為信號探針，以期在最優(yōu)實驗條件借助便攜式試紙條熒光讀數(shù)儀，實現(xiàn)水產(chǎn)品中4 種硝基呋喃代謝物的快速定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多寶魚、蝦 天津市場；呋喃妥因（nitrofurantoin，NFT）、呋喃它酮（furaltadone，F(xiàn)TD）、呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)ZD）、呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、AHD、AMOZ、AOZ、SEM、鄰硝基苯甲醛（2-nitrobenzaldehyde，2-NBA）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、AHD衍生物（NPAHD）、AMOZ衍生物（NPAMOZ）、AOZ衍生物（NPAOZ）、SEM衍生物（NPSEM）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide，EDC）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；熒光微球（fluorescent microsphere，F(xiàn)M） 美國Ocean Nano Tech公司；硝酸纖維素膜 美國Milllipore公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HM3035三維平面點(diǎn)膜噴金儀、ZQ2000微電腦自動斬切機(jī) 上海金標(biāo)生物有限公司；硝酸纖維素（cellulose nitrate，NC）膜、純水儀 美國Millipore 公司；熒光分光光度計 美國Thermo公司；Savant-100便攜式熒光讀數(shù)儀 天津博碩科技有限公司；ZF1-II紫外分析儀 上海嘉鵬科技有限公司；商業(yè)化ELISA 試劑盒 德國R-Biopharm AG公司。

1.3 方法

1.3.1 FMs-Ab復(fù)合物制備

取40 μL 10 mg/L熒光微球溶液于2 mL 0.02 mol/L pH 7.4磷酸緩沖液（phosphate buffer，PB）中，加入300 μg EDC和200 μg NHS，250 r/min攪拌活化2 h。置于100 mL離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心20 min后棄去上清液，將沉淀復(fù)溶于2 mL 0.02 mol/L pH 7.4 PB中，清洗2 次。逐滴加入一定量的抗體，置于磁力攪拌器上，常溫250 r/min緩慢攪拌1 h進(jìn)行偶聯(lián)。加入2 mg BSA，室溫靜置，避光反應(yīng)1 h進(jìn)行封閉。置于100 mL離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心30 min后棄上清液，將沉淀復(fù)溶于400 μL 0.02 mol/L pH 7.4 PB中。得到FMs-Ab復(fù)合物，置于4 ℃避光保存。

1.3.2 熒光微球免疫層析試紙條的組裝

熒光微球免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示，將樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼在PVC膠板上，以0.5 μL/cm的噴涂量將二抗、包被原分別作為控制線 （C線）和測試線（T線）劃在NC膜上，置于37 ℃干燥烘箱孵育6 h，用微電腦自動斬切機(jī)切成3.7 mm寬度的試紙條，置于密閉干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 熒光微球免疫層析試紙條組裝Fig. 1 Schematic diagram for the assembling of fluorescent microsphere immunochromatographic test strip

1.3.3 FMICA實驗條件的優(yōu)化

樣品緩沖液的種類、NC膜的種類、二抗、包被原的稀釋倍數(shù)及FMs-Ab添加量均影響試紙檢測的準(zhǔn)確性及靈敏度。本實驗選取不同pH值的PB、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、3 種不同的NC膜進(jìn)行試紙條檢測，最終選擇使試紙條C、T線FI一致且適中、熒光條帶清晰、背景干擾程度較小時的實驗條件為最優(yōu)條件。借助便攜式試紙條光讀數(shù)儀測出C、T線的FI值，分別記為FIC、FIT。當(dāng)添加樣品緩沖液測得的 FIT/FIC（空白）接近于1，且（FIT/FIC（加標(biāo)））/（FIT/FIC（空白）） 最小（抑制率最大）時為最佳二抗、包被原稀釋倍數(shù)和FMs-Ab添加量。

1.3.4 FMICA方法靈敏度檢測

確定好最佳抗體添加量、樣品緩沖液種類、二抗和包被原稀釋倍數(shù)及FMs-Ab最佳添加量條件后，用試紙條檢測樣品緩沖液（目標(biāo)物濃度為0）和一系列濃度梯度NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用便攜式試紙條熒光讀數(shù)儀測出FIC、FIT值，以目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)IT/FIC為縱坐標(biāo)，得到該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢出限定義為抑制率10%對應(yīng)的NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM濃度。

1.3.5 FMICA方法特異性驗證

選取硝基呋喃類獸藥原藥、代謝物、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物及其他常見獸藥，通過比較不同物質(zhì)的FIT/FIC值，驗證方法特異性。

1.3.6 實際樣品處理

衍生：將實際樣品粉碎后均質(zhì)，稱取1.0 g均質(zhì)后的樣品于50 mL的離心管中，加入4 mL去離子水和0.5 mL 1 mol/L HCl溶液混勻。加入100 μL的鄰硝基苯甲醛溶液（50 mmol/L），混勻后置于60 ℃水浴反應(yīng)3 h。

萃取：取出衍生后的樣品加入5 mL PBS和0.4 mL 1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，再加入5 mL乙酸乙酯，旋渦混勻30 s，于25 ℃、5 000 r/min離心10 min。取上層于玻璃試管中，50 ℃氮?dú)獯蹈桑貞矣? mL正己烷中，加入2 mL pH 7.4 PBS，振蕩混勻后，于25 ℃、5 000 r/min離心10 min，下層溶液備用。

1.3.7 方法有效性驗證

采用ELISA試劑盒驗證FMICA方法的有效性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 制備FMs-Ab時最佳抗體量的優(yōu)化

按照1.3.1節(jié)方法，添加不同抗體量制備FMs-Ab，分別用pH 7.4 PBS、1 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行試紙條檢測。當(dāng)試紙條C、T線FI一致且適中，靈敏度最理想時，抗體添加量即為最優(yōu)添加量。如圖2所示，在制備FMs-Ab復(fù)合物時，NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM抗體量分別添加90、70、60、60 μg時，試紙條C、T線FI一致且適中，且T線FI明顯減弱，靈敏度較高，此時為最佳添加量。

圖2 FMs-Ab制備中抗體添加量的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of antibody dosage in the preparation of FMs-Ab

2.2 樣品緩沖液的優(yōu)化

樣品緩沖液為試紙條的檢測提供反應(yīng)環(huán)境，其直接影響試紙條的靈敏度和準(zhǔn)確性。本實驗分別選取pH 5.7、7.4、8.5的PB和PBS為樣品緩沖液進(jìn)行試紙條檢測。如 圖3所示，樣品緩沖液為pH 7.4 PBS時，4 種試紙條C、T線的熒光強(qiáng)度一致且適中，效果最好，最終選擇pH 7.4 PBS為最佳樣品緩沖液。

圖3 FMICA樣品緩沖液的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of loading buffer used in FMICA

2.3 二抗、包被原的最佳稀釋倍數(shù)和FMs-Ab最佳添加量的優(yōu)化

4 種包被原（NPAHD-BSA、NPAMOZ-BSA、NPAOZ-BSA、NPSEM-BSA）分別稀釋70、50、20、100 倍，對應(yīng)二抗分別稀釋50、30、70、50 倍，F(xiàn)Ms-Ab分別添加5、3、5、3 μL時，AHD、AMOZ、AOZ、SEM熒光微球免疫層析試紙條FIT/FIC（空白）接近于1，且 （FIT/FIC（加標(biāo)））/（FIT/FIC（空白））最小（抑制率最大），此時為最佳二抗、包被原稀釋倍數(shù)和FMs-Ab添加量。

2.4 硝酸纖維素膜的優(yōu)化

選擇Milllipore HF 90s、135s、140s共3 種硝酸纖維素膜進(jìn)行優(yōu)化。如圖4所示，用Milllipore HF 90s硝酸纖維素膜上樣，C線FI適中，但其膜孔徑較大，層析過快，F(xiàn)Ms-Ab與T線上的包被原未充分結(jié)合，導(dǎo)致T線FI太弱。用Millipore HF 140s硝酸纖維素膜上樣，C線FI適中，但其膜孔徑較小，層析緩慢，F(xiàn)Ms-Ab與T線上的包被原過度結(jié)合，導(dǎo)致T線FI比C線強(qiáng)。最終選擇C、T線FI一致且適中、條帶清晰、無背景干擾的Millipore HF 135s硝酸纖維素膜。

圖4 硝酸纖維素膜的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of NC membrane

2.5 試紙條檢測方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

樣品緩沖液分別配制0、0.005、0.01、0.1、0.5、1、2、5 μg/L的NPAHD標(biāo)準(zhǔn)品溶液和0、0.01、0.05、0.1、1、2、5、10 μg/L的NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行試紙條檢測，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。AHD、AMOZ、AOZ、SEM熒光免疫層析試紙條FIT/FIC（y）與目標(biāo)物質(zhì)量濃度（x）的線性方程分別為：y=－0.249 06lgx+0.217 38（R2=0.990 49）、y=－0.222 41lgx+0.481 98（R2=0.990 79）、y= －0.215 89lgx+0.398 11（R2=0.992 32）、y=－0.240 88lgx+ 0.500 61（R2=0.991 14），線性均良好（R2＞0.99）。檢出限分別為0.004、0.01、0.008、0.009 μg/L，檢測線性范圍分別為0.005～5、0.01～10、0.01～10、0.01～10 μg/L。

2.6 特異性評價

選取4 種硝基呋喃類藥物原藥、代謝物、結(jié)構(gòu)類似物及其他常見獸藥進(jìn)行方法特異性評價。添加質(zhì)量濃度均為5 μg/L的 NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM標(biāo)準(zhǔn)品，代謝物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為100 μg/L，原藥質(zhì)量濃度為100 μg/L，結(jié)構(gòu)類似物、常見獸藥質(zhì)量濃度均為1 000 μg/L，用便攜式試紙條熒光讀數(shù)儀測定得出結(jié)果，如圖5所示，AHD、AMOZ、AOZ、SEM熒光微球免疫層析試紙條分別對NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM的FIT/FIC有較強(qiáng)響應(yīng)，對代謝物和原藥響應(yīng)較小，其原因為代謝物的衍生物、代謝物和原藥具有部分相似化學(xué)結(jié)構(gòu)。其他結(jié)構(gòu)類似物和常見獸藥沒有交叉反應(yīng)，這些物質(zhì)對檢測結(jié)果沒有影響。

圖5 FMICA方法的交叉反應(yīng)Fig. 5 Cross-reactivity of FMICA

2.7 實際樣品的檢測與有效性驗證

表2 實際樣品中AMOZ的回收率（n=3）Table 2 Recoveries of AMOZ in spiked samples (n= 3)

表3 實際樣品中AOZ的回收率（n=3）Table 3 Recoveries of AOZ in spiked samples (n = 3)

選取多寶魚、蝦作為實際樣品，將質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、1 μg/L的4 種代謝物標(biāo)準(zhǔn)品分別添加到實際樣品中，用FMICA方法及商業(yè)化ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。其實測含量、回收率、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）結(jié)果如表1～4所示，F(xiàn)MICA方法測出AHD、AMOZ、AOZ、SEM回收率為75.88%～104.81%，CV為1.90%～10.61%，商品化ELISA試劑盒的添加回收率為81.89%～107.65%，CV為2.57%～7.29%。2 種方法檢測結(jié)果一致，證明FMICA方法準(zhǔn)確性好，且FMICA方法能快速、簡單地實現(xiàn)對多寶魚、蝦中AHD、AMOZ、AOZ、SEM的定量檢測。

表1 實際樣品中AHD的回收率（n=3）Table 1 Recoveries of AHD in spiked samples (n = 3)

表4 實際樣品中SEM的回收率（n=3）Table 4 Recoveries of SEM in spiked samples (n = 3)

3 結(jié) 論

本研究采用FM納米材料作為信號標(biāo)記物，基于抗原抗體的特異性結(jié)合作用，建立FMICA法用于定量檢測水產(chǎn)品中4 種硝基呋喃類獸藥代謝物的殘留。與儀器驗證方法相比，本研究建立的方法檢測時間更短、操作更簡單。與傳統(tǒng)ELISA方法相比，靈敏度更高、操作更簡單。與膠體金免疫層析檢測方法相比，本方法在保留快速、簡單的優(yōu)勢的同時，檢測靈敏度更高。實際樣品中硝基呋喃類獸藥含量的測定結(jié)果與商品化ELISA試劑盒的測定結(jié)果具有理想的一致性，因此本方法具有很好的準(zhǔn)確性和實用性。此外，F(xiàn)M納米材料由于其優(yōu)良的光學(xué)特性，其作為信號標(biāo)記物在建立食品中小分子危害物的高靈敏、快速定量檢測方法中具有良好的應(yīng)用前景。