高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術非靶向快速篩查荔枝花、蜂巢和蜂蜜中農藥

王思威，孫海濱，劉艷萍，曾廣豐，王瀟楠，常 虹，曾鑫年

（1.華南農業大學 廣東省昆蟲行為調控工程技術研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省農業科學院植物保護研究所， 廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510623）

荔枝原產于中國，是我國熱區的第一大水果[1-2]，是最具嶺南特色的名優果品，中國是世界上荔枝產量最大和栽培面積最廣的國家[3-5]，荔枝是我國華南地區重要的蜜源性經濟作物。嶺南高溫高濕的氣候環境特征導致荔枝上病蟲害頻發[6]，尤其在荔枝花期和果期，病蟲害發生可導致荔枝的成花率低、坐果率下降，從而影響荔枝的產量和質量[7]。目前化學防治仍為主要技術措施。荔枝上主要病蟲害有蒂蛀蟲、椿象、霜疫霉病、炭疽病等，主要防控藥劑為菊酯類、苯甲酰脲類、有機磷類、甲氧基丙烯酸酯類、三唑類等化學農藥[8-13]。荔枝需要借助蜜蜂等昆蟲媒介完成授粉，蜜蜂在授粉過程中也將蜜汁和花粉帶回蜂巢，受農藥的內吸傳導特性和漂移作用影響，荔枝花中的蜜汁和花粉會含有部分農藥，通過蜜蜂轉運作用，蜂巢和蜂蜜中也會存在農藥殘留[14-15]。因此，本研究以荔枝花、蜂巢和蜂蜜為篩查對象，快速分析其中的農藥殘留水平，為后續評估農藥對蜜蜂的暴露風險等研究內容提供基礎。

目前，有關蜂蜜中農藥的檢測方法一般為氣相色譜（gas chromatography，GC）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）聯用法、高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[16-25]，其中GC法和HPLC法的定性能力較弱，且GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS/MS法的定性分析必須有標準物質進行比對。四極桿飛行時間質譜（quadrupoletime of flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）具有數據采集速度快、分辨能力高、質量精度高、檢測靈敏度高等多重優點，可依據化合物的質量數、保留時間、同位素強度、二級碎片等質譜信息匹配數據庫，從而實現在無標準品比對的條件下對目標化合物進行定性，該技術在農產品、畜產品等領域中有害物質篩查方面得到廣泛 應用[26-30]。目前鮮見以荔枝花、蜂巢和荔枝蜜為基質的農藥篩查分析報道。

本實驗以荔枝花、蜂巢和蜂蜜為研究對象，采用改進的QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）前處理方法結合HPLC-Q-TOF-MS技術快速篩查多種農藥。該法分析速度快、精準可靠，旨在為全面快速分析荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的農藥多殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；甲酸（色譜純） 美國Fluka公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

農藥標準物質（純度≥95%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司。準確稱取適量標準品，用乙腈稀釋成1 000 mg/L的標準儲備液；分別準確吸取1 mL各標準儲備液，用含0.1%甲酸的乙腈溶液定容至10 mL，配制100 mg/L混合標準溶液，于4 ℃避光保存。

1.2 儀器與設備

20AD高效液相色譜儀 日本島津公司；TripleTOF? 5600+高分辨質譜儀 美國AB SCIEX 公司；Milii-Q超純水機 美國Millipore公司；GTR22-1離心機 北京時代北利離心機有限公司；OA-SYS 氮吹儀 美國Organomation Associates公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取荔枝花或蜂巢樣品5.0 g，荔枝蜜樣品10 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入10 mL超純水浸潤荔枝花和蜂巢樣品，渦旋使蜂蜜樣品成均質溶液，在45 ℃水浴中放置30 min，再加入20 mL乙腈進行提取，然后加入5 g氯化鈉和2 g無水硫酸鎂，立即劇烈振蕩，渦旋1 min，以5 000 r/min離心5 min。取10 mL乙腈層溶液，氮氣吹至約50 μL，乙腈定容至2 mL，轉移至加有0.15 g無水硫酸鎂、0.025 g PSA和0.025 g C18的離心管中，劇烈振蕩，渦旋10 s，再以10 000 r/min離心2 min。取上清液，過0.22 μm有機濾膜，待HPLC-Q-TOF-MS測定。

1.3.2 檢測條件

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫30 ℃；梯度洗脫：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫條件見表1；進樣量5 μL；流速0.5 mL/min。

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution procedures

1.3.2.2 質譜條件

離子源：大氣壓電噴霧電離源和大氣壓化學電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）復合源；APCI源：連接AB SCIEX公司自動校正系統，每5 個樣品自動校正1 次，以保證系統精確質量數的穩定性。校正液流速0.5 mL/min；一級TOF-MS掃描準確質量范圍100～1 000 Da；數據采集時間100 ms；二級IDA-MS掃描準確質量范圍50～1 000 Da；高靈敏模式；數據采集時間50 ms；信號閾值100 cps。IDA實驗每循環采集6 次數據，動態背景減法扣除。離子源內參數見表2。

表2 TOF-IDA-MS模式質譜參數Table 2 Spectrometric parameters under the TOF-IDA-MS mode

1.3.3 篩查與鑒定方法

高分辨質譜數據在AB SCIEX公司的Analyst TF 1.6軟件采集，采用PeakView 2.0、MasterView 2.0軟件對實際樣品中的農藥殘留進行篩查。結合荔枝上登記的農藥種類、荔枝產地實際樣品調研及測定結果、荔枝上的相關技術規程，導入45 種農藥的名稱和分子式，建立高分辨質譜篩查XIClist列表，該列表的建立是篩查分析的重要依據，直接影響結果的準確性。篩查列表保留時間限定范圍為±0.2 min，精確質量偏差為±1×10－5，離子化模式設定為+H模式。軟件會計算化合物的實測值與理論值的偏差，通過分子離子的精確質量偏差、同位素分布、同位素比例和保留時間等的計算，給出相應的檢索匹配得分值，對于檢索結果得分值不小于80的化合物，本方法確認其為檢出農藥。根據上述篩選出的化合物，對其標準品進行儀器分析，進一步驗證篩查結果的準確性，利用基質匹配標準溶液進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化及評價

荔枝花、蜂巢和蜂蜜中含有大量糖類、色素、黃酮類物質，屬于較復雜基質，樣品如果不經凈化直接進樣，容易對目標物的定性定量分析產生干擾，影響確證的準確性，同時會對色譜柱、質譜系統等造成嚴重污染，導致儀器日常維護的人力和財力成本增加。因此對荔枝花、蜂巢和蜂蜜樣品的凈化十分必要。

蜂巢和蜂蜜樣品中含有大量糖分，通過在45 ℃水浴中放置30 min，可使樣品中的糖類充分溶解出來，避免凝固，影響后續凈化過程；水浴溫度過高可導致未知農藥的分解現象發生，影響定性定量結果。目前水果、蔬菜等中的有害化學物質的限量水平越來越低，因此需要更為有效和更加靈敏的分析方法檢測復雜基質中的有害物質含量，QuEChERS法具有操作簡便快速、分析物回收率穩定的獨特優勢，使其廣泛應用于果蔬等多種基質中的農殘檢測。

提取溶劑選擇乙腈，是因其具有極性強、提取范圍廣、提取農藥種類多以及提取樣品色素雜質少等特點，是農藥殘留檢測中常用的提取溶劑。荔枝花和蜂巢樣品中含有大量蜂蠟、樹脂、色素等成分，蜂蜜樣品中含有糖類物質，PSA屬弱陰離子交換填料，可有效去除樣品中的色素和糖類等物質；C18吸附劑具有較大的比表面積，對脂肪、脂類等非極性干擾物具有較強的吸附能力，去除效果顯著；無水硫酸鎂主要用于去除樣品中的多余水分，增加目標農藥在有機溶劑中的溶解度。通過PSA+C18聯合應用能夠明顯去除脂類和糖類物質的干擾，使目標物的添加回收率滿足分析要求。

2.2 定性分析

自建高分辨數據庫是實現非靶向篩查的基礎，將待篩查領域項目中所涉及的所有化合物分子式導入MasterView 2.0構成篩查數據庫。本研究一級質譜和二級質譜兼顧高分辨率和高靈敏度平衡模式，得到的譜圖既有母離子的精確質量數，又自動觸發母離子峰高大于5 000 cps的二級質譜全掃描采集，完全滿足定性和定量要求。采集的一級質譜圖包含化合物的精確質量數和分子式。樣品中8 種篩選出農藥的一級提取離子流色譜圖見圖1。使用一級譜圖對篩查出的可疑農藥根據同位素分布和精確質量數進行匹配分析。如果一級譜圖信息匹配成功，再根據二級碎片信息進行匹配。通過ChemDraw Ultra 12.0軟件繪制可疑農藥的結構式，并將其導入PeakView 2.0軟件中，將結構與二級碎片進行匹配，結合相應的檢索匹配得分值判斷目標化合物是否檢出（表3）。

圖1 8 種篩選出農藥的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of eight selected pesticides

表3 8 種篩選出農藥的保留時間和質譜信息Table 3 Retention time and mass spectral information of eight pesticides

以嘧菌酯篩查為例，建立非靶向篩查農藥的分析方法時，將其分子式輸入篩查列表中，并定義離子化模式為[M+H]+，得到的提取離子流色譜圖見圖2A，可知嘧菌酯的精確質量數誤差為0.31 mDa，小于高分辨質譜允許的誤差5 mDa。母離子同位素分布見圖2B，同位素比值與嘧菌酯理論同位素分布匹配度為98.5%。調用其二級質譜圖，結合其結構式進行結構與二級精確質量數的匹配，結果見圖2C，嘧菌酯的3 個豐度最大的碎片與結構完全匹配，3 個碎片精確質量數誤差小于0.000 1 Da。由此判斷樣品中的農藥為嘧菌酯。為了驗證篩查結果的準確性，對嘧菌酯的標準品進行分析，嘧菌酯標準品的保留時間、一級精確質量數、一級同位素分布、二級碎片信息與樣品中篩查出的農藥完全吻合，證明了該方法的可靠性。

圖2 嘧菌酯篩查分析圖Fig. 2 Screening and analysis of azoxystrobin

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍和定量限

配制8 種農藥在荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的基質匹配標準溶液，以峰面積y為縱坐標，對應的質量濃度x（μg/L）為橫坐標繪制標準曲線。結果顯示，各農藥在1～1 000 μg/L范圍內均呈良好線性關系，相關系數均大于0.99。以3 倍信噪比確定方法的檢出限，以實際添加最低質量濃度確定方法的定量限，8 種農藥的檢出限為0.03～0.5 μg/kg，定量限為0.4～0.8 μg/kg。

2.3.2 回收率和精密度實驗結果

在1、10 μg/kg和100 μg/kg的添加量下8 種農藥在荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的平均加標回收率分別為80%～95%、81%～95%和81%～96%，相對標準偏差分別為1.2%～5.0%、1.5%～4.1%和1.2%～6.1%，符合殘留分析檢測要求（表4）。

2.4 實際樣品檢測結果

對某地區4 個荔枝園內的荔枝花、蜂巢和蜂蜜樣品進行篩查和定量分析（表5），結果顯示每個果園樣品均有農藥檢出，檢出頻次較多的農藥有苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯和除蟲脲。我國暫未規定蜂蜜中上述農藥的最大殘留限量，歐盟規定蜂蜜中苯醚甲環唑最大殘留限量為0.05 mg/kg，除蟲脲最大殘留限量為0.05 mg/kg，實際荔枝蜜樣品檢測值均低于歐盟標準。

表5 荔枝花、蜂巢和蜂蜜樣品實測結果Table 5 Results of analysis of pesticide residues in litchi flower, hive and honey by HPLC-Q-TOF-MS μg/kg

3 結 論

本實驗建立了QuEChERS與HPLC-Q-TOF-MS法快速篩查與確證荔枝花、蜂巢和蜂蜜中的多種農藥殘留痕量分析方法，該方法在樣品基質復雜以及無標準品條件下，可根據一級TOP-MS和二級IDA-MS信息，實現樣品中農藥的鑒定與分析，方法簡便快速、靈敏度高。