基于染料Genefinder和適配體的熒光傳感 體系檢測赭曲霉毒素A

郭 婷，葉志杰，周鴻媛，張宇昊,2，馬 良,2,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學生物學研究中心，重慶 400715）

目前，赭曲霉毒素污染農產品現象越來越嚴重，因此引起高度重視。2020年7月，愛爾蘭食品安全局發布預警通報，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）含量升高，立即下令召回一批小麥片。赭曲霉毒素是由曲霉屬、青霉屬的真菌產生的有毒次級代謝產物[1-2]，常見的赭曲霉毒素有OTA、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C，其中毒性最大且最受關注的是OTA，其廣泛存在于糧食及其制品中，具有致畸、致癌、致突變等多種毒性，已被國際癌癥研究機構列為2B類致癌物[3]。目前針對OTA的檢測方法主要包括色譜法[4-7]、免疫法[8-10]。 其中色譜法準確度高，但樣品前處理復雜，需昂貴的大型儀器、專業人員操作，僅適合實驗室操作，無法達到目前食品安全快速檢測的要求。免疫法作為快速檢測方法，具有操作簡單、靈敏度高、檢測快的特點，但是其核心元件是抗體，存在制備時間長、穩定性差、不易保存、假陽性等問題。

近年來，生物傳感器法因其微型、智能、多功能等特點，受到越來越多的關注。目前生物傳感器已被廣泛應用于臨床診斷、食品分析、生物監測等方面[11-13]。生物傳感器的核心部件分別為識別、傳感元件。傳統的識別元件是生物抗體等活性物質，由于其穩定性問題限制了傳統生物傳感器的進一步推廣與應用。而適配體技術可有效解決上述問題。適配體為對目標物具有高特異性結合能力的DNA或RNA[14-16]。與抗體相比，適配體可體外合成，且制備價格低，穩定性好，以適配體為識別元件的生物傳感器在食品安全檢測領域有巨大的應用潛力。Zhang Jing等[17]采用AgPt雙金屬納米粒子修飾的金屬有機框架構建適配體電化學傳感器檢測OTA，檢出限（limit of detection，LOD）為14 fg/mL。Li Yapiao等[18]采用熒光標記探針開發具有信號關閉或信號打開的競爭性熒光各向異性方法測定OTA。Zhu Weiran等[19]構建可同時檢測OTA和AFB1的比色傳感器，該傳感器對OTA的檢測范圍為0.5～80 ng/mL，對AFB1的檢測范圍為5～250 ng/mL。Ma Liang等[20]開發基于磁性石墨烯的熒光傳感器檢測展青霉毒素，熒光染料FAM修飾的適配體通過靜電相互作用吸附在磁性石墨烯表面，磁性石墨烯與FAM染料發生能量共振轉移現象，染料的熒光被強烈猝滅，加入展青霉毒素時，適配體識別展青霉毒素，并與其形成一定的結構，從而從磁性石墨烯表面釋放，熒光強度恢復，根據熒光強度的變化檢測展青霉毒素。

Genefinder染料是花青素類的染料，具有安全環保、毒性低、靈敏度高等特點[21-22]。該染料與雙鏈DNA作用后熒光會增強800～1 000 倍，因此其常用于電泳中核酸染色[22-23]，而檢測方面的應用鮮見報道[22]。因此，本研究以適配體為識別元件，熒光染料Genefinder為傳感元件，采用熒光染料特殊的熒光特性構建熒光傳感體系，實現快速、高靈敏檢測OTA。檢測原理圖如圖1所示，首先OTA適配體與其互補鏈形成雙鏈結構，Genefinder染料與此雙鏈結構DNA結合后產生較強的熒光信號，然后加入毒素OTA，適配體與OTA結合形成四鏈體結構，雙鏈打開，Genefinder染料熒光強度降低。根據熒光強度的改變檢測目標物OTA含量。

圖1 傳感體系的檢測原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the sensing system

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅酒購于本地超市。

OTA適配體（5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAA GGGAGCATCGGACA-3’）[24]及其互補鏈（5’-TGTAAGA TGCTCACTTTATAACACTCACACTAGATC-3’） 生工 生物工程（上海）有限公司；染料Genefinder 合肥 博美生物科技有限責任公司；OTA、黃曲霉毒素M1（aflatoxins M，AFM1）、黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxins B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxins G1，AFG1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、單端孢霉烯（trichothecenes-2，T-2）毒素標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；臺式高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA濃度測定

采用紫外-可見分光光度計測定適配體DNA在260 nm波長處的吸光度，依據朗伯比爾定律計算得DNA濃度，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）將其配制成500 nmol/L DNA溶液，于－20 ℃備用。

1.3.2 熒光傳感器構建

DNA母液解凍后，水浴90 ℃處理10 min，逐漸冷卻至室溫（退火）備用。研究孵育時間對傳感器的影響。取50 μL 500 nmol/L OTA適配體與等體積等濃度互補鏈混合，再加入2.5 μL質量濃度1 mg/L的OTA溶液，孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，得到終體積500 μL、OTA適配體及互補鏈終濃度50 nmol/L、OTA終質量濃度5 μg/L的混合溶液，設定激發波長500 nm、發射波長529 nm測定其熒光光譜，無目標物、添加目標物時的熒光強度分別記為F0、F。

研究適配體濃度對傳感器的影響。將一定濃度的OTA適配體與等體積等濃度互補鏈混合，再加入終質量濃度為5 μg/L OTA孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，測定熒光光譜。

1.3.3 熒光傳感器性能分析

OTA適配體及其互補鏈退火后，將等體積等濃度的OTA適配體及其互補鏈混合（終濃度為50 nmol/L），再加入不同濃度OTA孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，測定熒光光譜。

OTA適配體及其互補鏈退火后，將等體積等濃度的OTA適配體及其互補鏈混合（終濃度為50 nmol/L），再分別加入5 μg/L OTA，10 μg/L T-2、ZEN、AFB1、AFB2、AFM1、AFG1及混合毒素（5 μg/L OTA與10 μg/L T-2、ZEN、AFB1、AFB2、AFM1、AFG1混合）孵育60 min后，加入2 μL Genefinder 100×，測定其熒光值。

1.3.4 實際樣品中OTA的檢測

向紅酒樣品中加入一定量OTA，分別配成質量濃度為2、5、10 μg/L的陽性樣本。將紅酒樣于室溫、15 000 r/min離心5 min取上清液，稀釋100 倍后，按照構建的熒光傳感體系檢測OTA。

1.4 數據處理

運用Excel軟件分析數據，運用Origin軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 傳感體系的檢測原理

以OTA為研究對象，其適配體為識別元件，Genefinder為傳感元件構建熒光傳感體系。以500 nm為激發波長，從圖2可知，僅有OTA溶液的條件不產生熒光信號，因此不影響熒光傳感體系的準確度。OTA適配體及互補鏈分別與染料Genefinder作用后產生較微弱的熒光信號。適配體、互補鏈混合后再加入Genefinder，熒光強度明顯增強，其原因為適配體與互補鏈形成了雙鏈結構，Genefinder與雙鏈結構作用產生較強的熒光。適配體、互補鏈混合體系中再次加入OTA后，適配體與OTA形成四鏈體結構，導致雙鏈打開，熒光強度降低。因此，可通過檢測熒光信號強度與體系中OTA質量濃度的關系，定量檢測OTA。

圖2 不同條件的熒光強度Fig. 2 Fluorescence intensity under different conditions

2.2 傳感體系的構建

2.2.1 孵育時間

適配體對目標物的識別需要一定時間，孵育時間過短可能造成部分適配體未能識別目標物。因此本實驗研究10～120 min孵育時間對熒光信號的影響。孵育時間與熒光信號強度的關系見圖3，結果表明，10～60 min內隨著孵育時間的延長，熒光猝滅量逐漸增強，適配體與OTA孵育60 min，熒光猝滅量達到最大，60 min后熒光猝滅量無明顯變化，說明孵育時間為60 min時，體系中OTA適配體與OTA的結合已飽和。因此，選擇孵育時間60 min進行后續實驗。

圖3 孵育時間對熒光強度的影響Fig. 3 Effect of incubation time on fluorescence intensity

2.2.2 適配體濃度

如圖4所示，隨著OTA適配體濃度的增加，熒光猝滅強度也逐漸增加，適配體濃度為50 nmol/L時達到平衡。為了滿足實驗需求、節約成本，后續實驗適配體濃度選擇50 nmol/L。

圖4 適配體濃度對熒光強度的影響Fig. 4 Effect of aptamer on the fluorescence intensity

2.3 熒光傳感體系的性能分析

2.3.1 熒光傳感體系與OTA質量濃度的線性關系

在最佳的實驗條件下，構建熒光傳感體系，考察熒光傳感體系對不同質量濃度OTA的熒光響應情況。如 圖5A所示，隨著OTA質量濃度的增加，熒光強度逐漸減弱，其原因為OTA的加入破壞雙鏈結構。從圖5B可知，OTA質量濃度在50 pg/L～300 ng/L范圍內，1－F/F0與OTA質量濃度的對數呈線性，線性方程為y=0.121lgx+0.542（R2=0.996），該傳感體系的實際LOD為50 pg/L，結果表明該熒光傳感體系具有較高的靈敏度。從表1可知，與近年來檢測OTA的熒光傳感方法相比，該方法仍然具有一定的競爭力。

圖5 不同質量濃度OTA對所構建傳感體系熒光響應變化（A）及 1－F/F0與OTA質量濃度對數的線性關系（B）Fig. 5 Fluorescence spectra of the sensor with different concentrations of OTA (A) and influence of OTA concentration on fluorescence intensity (B)

表1 OTA的熒光檢測方法的LOD和線性范圍Table 1 LODs and linear ranges of fluorescent methods for OTA detection

2.3.2 熒光傳感體系的選擇性

以AFB1、AFB2、AFM1、AFG1、ZEN、T-2為樣本考察該傳感體系的選擇性。實驗中OTA質量濃度為5 μg/L，對照毒素質量濃度均為OTA的2 倍。如圖6所示，加入OTA后熒光傳感體系的熒光強度猝滅量最大，這是因為傳感體系中使用的適配體與OTA可以特異性結合，而與其他毒素無明顯作用。另外，研究OTA與其他對照毒素共存時熒光傳感體系的性能，結果表明其他毒素對傳感體系并無明顯影響，說明該傳感體系對OTA具有較好的選擇性。

圖6 熒光傳感體系的選擇性Fig. 6 Selectivity of the sensing system

2.4 實際樣品測定

為了考察傳感體系實際測定效果，以紅酒作為實際陰性樣品，研究加標回收情況。如表2所示，采用傳感體系檢測的加標回收率在101.9%～105.6%的范圍內，這說明該熒光傳感體系可用于測定真實樣品中的OTA。

表2 實際樣品加標回收率（n=3）Table 2 Spike recoveries for real sample (n= 3)

3 結 論

本實驗構建簡單的基于染料Genefinder和適配體的熒光傳感體系，可用于高靈敏度、高特異性檢測OTA。在最優條件中，該熒光傳感體系的線性范圍50 pg/L～ 300 ng/L，實際LOD為50 pg/L。實際樣品檢測效果理想，說明本傳感體系在食品安全檢測中具有較強實用性，為開發簡單、快速、靈敏和高選擇性的食品安全生物傳感體系提供了新的思路。