銅納米顆粒的仿生合成及其在CT成像中的應用

張 欣，褚中運，賈能勤

（上海師范大學化學與材料科學學院，上海200234）

0 引言

銅（Cu）納米材料作為一種重要的金屬材料，具有優異的導電導熱性、延展性等性能，并且儲量豐富、價格便宜、環境友好.因此，在生命科學領域已經展示了良好的應用前景［1-4］.目前，制備Cu納米顆粒的方法有很多［5-6］，主要包含電解法、化學沉淀法、物理氣相沉積法、水熱法和溶膠-凝膠法等，以上所述的方法各具有不同的特點，但是這些方法不但生產成本高、工藝復雜，并且容易團聚，很難滿足生命科學領域的應用要求［7-8］.基于綠色化學理念指導的生物仿生合成是納米材料制備的發展趨勢，其中蛋白類生物大分子已經成為金屬納米材料合成中最受歡迎的生物模板之一，具有價格便宜、適宜大規模生產、較好的穩定性和水溶性，以及豐富的表面功能團等優良性能，以此方法合成的納米顆粒，進一步拓展了其在生物醫學方面的應用范圍［9］.另外，金屬納米粒子對電子計算機斷層掃描（CT）造影劑的豐富和發展起到了極大的推動作用，金屬原子具有高原子序數和出色的X射線衰減特性，在相同濃度下，金屬納米粒子提供比碘基造影劑更高的對比度［10-12］.在Cu納米粒子的CT成像應用中［13］，一種靶向胃癌的硫化銅（CuS）納米粒子證明了其良好的CT成像效果［14］，通過簡單構建聚乙烯吡咯烷酮修飾的硫化銅/鉑納米粒子（Cu2-xS：Pt（0.3）/PVP）納米粒子，可以實現CT成像介導的化學光熱協同治療［15］.本研究中，以蛋清提取物——蛋清白蛋白（CEW）為生物模板，通過條件溫和的一鍋法合成了粒徑均一、水溶液分散性和多溶液體系穩定性、生物相容性良好，并具有一定CT增強成像效果的表面包裹蛋清蛋白的納米銅材料（Cu＠CEW）.其合成步驟和應用如圖1所示.

圖1 以CEW為模板的Cu＠CEW制備流程及應用示意圖

1 實驗

1.1 試劑及藥品

實驗使用的所有試劑均為分析純等級.氫氧化鈉（NaOH）和五水合硫酸銅（CuSO4·5H2O）等均購自西格瑪；細胞活力試劑盒（CCK-8）購自碧云天生物技術有限公司；所采用的細胞模型包括人肺癌細胞A549購自中科院細胞庫；細胞培養所使用的試劑RPMI 1640培養基和胎牛血清（FBS）等均購自上海秉新生物科技有限公司；實驗過程中的用水均為二次超純水.

1.2 Cu＠CEW納米顆粒的制備

稱取CuSO4·5H2O固體44.7 mg，并在3.581 mL二次水中使其溶解，取其中0.5 mL加入到圓底燒瓶中；稱取提取的CEW 250 mg，并量取9.5 mL二次水配制成CEW溶液，將其加入到圓底燒瓶中.使圓底燒瓶中的溶液體系保持在57℃的恒溫水浴鍋中，持續磁力攪拌10 min（650 r·min-1）后，迅速加入物質的量濃度為1 mol·L-1的NaOH溶液，調節溶液pH為10后繼續攪拌8 h，將過濾所得的產物置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥.取適量制備得到的Cu＠CEW溶解于PBS中配成溶液，利用電感耦合等離子體發射光譜（ICP-OES）精確定量其中Cu的濃度，并保存于4℃冰箱中待用.

1.3 Cu＠CEW納米顆粒的穩定性評價

將制備好的Cu＠CEW納米顆粒分散在水、PBS、1640細胞培養液和血清中，分別靜置12 h和7 d，觀察Cu＠CEW納米顆粒的多溶液體系溶解性和穩定性.

1.4 細胞培養和體外細胞毒性分析

采用A549細胞作為細胞模型研究Cu＠CEW納米顆粒的生物安全性.首先，用完全培養液充分培養A549細胞（37℃，體積分數為5%CO2），以每孔8 000個的密度接種到96孔板中.其次，在對數生長期，移除完培液后，用100μL新鮮的完全培養基（Cu＠CEW納米顆粒的質量濃度為0，5，10，15，20，30μg·mL-1）繼續培養24 h和48 h.最后，通過CCK-8測定方法測定A549細胞的細胞存活率.

1.5 Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減測試

將不同物質的量濃度的Cu＠CEW納米顆粒和碘海醇（Iohexol）轉移到EP管中進行X射線衰減測試.CT掃描通過Brilliance 64切片系統（Philips Healthcare，Andover，MA），切片厚度為0.625 mm，管電壓為120 kV，視場（FOV）為25.0 cm，管電流為80 mA.CT信號強度通過臨床常用的亨氏單位，數值反映：亨氏單位數值越大，CT成像效果越明顯.

2 結果與討論

2.1 Cu＠CEW納米顆粒的合成與表征

將制備好的納米顆粒均勻分散在水溶液中，借助透射電子顯微鏡（TEM）成像，如圖2（a）所示；隨機選取200個點，通過分析測得其平均粒徑為4.62 nm，標準差（σ）為0.56 nm，如圖2（b）所示.圖2（a）中納米顆粒呈現出均勻的分散狀態，表明沒有明顯的團聚現象.在紫外可見吸收光譜中，280 nm左右的吸收峰為CEW的特征吸收，證明了納米顆粒被CEW所包裹，如圖3所示.

圖2 Cu＠CEW的（a）TEM和（b）粒徑分布圖

圖3 Cu＠CEW的紫外可見吸收光譜圖

2.2 Cu＠CEW納米顆粒的穩定性

在生物應用中，納米顆粒需要具有良好的多溶液分散性和穩定性.將Cu＠CEW納米顆粒溶解在水、PBS、1640細胞培養基和FBS中分別靜置12 h和7 d，如圖4所示，沒有發現明顯可見的聚集或沉淀.表明Cu＠CEW納米顆粒不僅具有良好的多溶液體系分散性，而且顯示出CEW生物模板制備的納米顆粒的優異膠體穩定性.

圖4 Cu＠CEW在不同介質中（水、PBS、1640細胞培養基、FBS）的分散性和不同時間（12 h，7 d）穩定性比較

2.3 Cu＠CEW納米顆粒的生物相容性

體外細胞毒性是作為評價納米材料生物相容性的一項重要指標，本研究將A549細胞與Cu＠CEW納米顆粒（0～30μg·mL-1）共孵育24 h和48 h后，通過標準CCK-8分析方法，進一步評估了Cu＠CEW納米顆粒的細胞毒性.如圖5所示，隨著材料濃度的增大和孵育時間的延長，A549細胞的細胞存活率仍然保持在80%以上，這表明Cu＠CEW納米顆粒具有比較低的細胞毒性.

圖5 基于CCK-8分析方法的A549細胞與Cu＠CEW孵育24 h和48 h后的細胞存活率

2.4 Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減性質

CT成像造影劑必須具有良好的X射線衰減行為.本實驗以現代醫療常規使用的造影劑碘海醇作為對照組，測量Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減.如圖6（a）所示，Cu＠CEW納米顆粒的CT成像亮度隨著物質的量濃度的增加作有規律的變化，相較于同濃度下的碘海醇具有更好的成像效果，這進一步反映于圖6（b）中的亨氏單位值（HU）變化趨勢上，在相同的濃度條件下，Cu＠CEW納米顆粒具有更高的HU值.因此，Cu＠CEW納米顆粒具有明顯的CT增強效應.

圖6 Cu＠CEW納米顆粒的X射線衰減性能.（a）0～10 mmol·L-1的Cu＠CEW納米顆粒和碘海醇的CT成像明度圖；（b）0～10 mmol·L-1的Cu＠CEW納米顆粒和碘海醇的HU值直線圖

3 結論

本研究提出了一種簡單的方法，使用生物模板蛋清提取物CEW，作為穩定劑來制備Cu＠CEW納米顆粒，并將其應用于CT成像.通過一鍋法合成了均勻分散的Cu＠CEW納米顆粒，平均粒徑為4.62 nm.通過穩定性測試，證明其良好的多溶液體系相溶性，而且在較長的時間周期內能夠穩定存在而不會出現聚沉現象.以A549細胞為模型，通過細胞毒性實驗表明：Cu＠CEW納米顆粒在較高的濃度條件下具有比較低的細胞毒性.進一步與臨床常用的CT造影劑碘海醇相比，該納米粒子具有更好的CT成像效果.