濃香型大曲菌系、酶系的研究進展

汪凌旭，易卓林，趙 海，黃 丹，羅惠波

（1. 四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000；2. 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3. 中國科學院環境與應用微生物重點實驗室，成都 610041；4. 環境微生物四川省重點實驗室 成都 610041）

引 言

大曲是以小麥為主要原料制成的形狀較大、含有豐富菌系和酶系的曲塊，是釀酒用的糖化劑及發酵劑。大曲作為一種最古老的粗酶制劑，很早就被廣泛應用于我國的釀酒行業。與西方純菌液態發酵的蒸餾酒相比，大曲酒是由多種微生物固態發酵所制成的大曲為發酵劑，采用獨特的邊糖化邊發酵的固態發酵工藝釀造而成。大曲獨一無二的固態制曲和固態發酵工藝［1］，是它區別于國外所有蒸餾酒的關鍵。

大曲的制作工藝復雜，大致包括潤麥、粉碎、拌料、成型、入室培菌、打攏以及入庫貯存等步驟［2］。制曲過程中，大曲在開放條件下網羅自然界中的微生物。大曲中多種微生物混合生長，經協同和競爭發展，最終形成了穩定的特色菌系。大曲微生物生長的同時，還產生多種酶和代謝產物，使大曲成為3 種體系平衡的復合體。影響大曲平衡的因素有很多，原料、水分、pH、溫度等因素都能影響微生物的生長以及酶和代謝產物的生成［3］。進一步研究證實，微生物的多樣性及其所產功能酶的協同作用是形成白酒感官風味的關鍵，對大曲的好壞起決定性的作用，所以對大曲中菌系和酶系的研究顯得尤為重要。大曲微生物的研究可分為培養方法與非培養方法兩種。培養方法指無菌接種，分離培養大曲中的微生物菌種，并對其生理及代謝功能進行研究。該方法可為后續研究白酒的化學性質和形成機理提供基礎數據。非培養方法主要是指聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）、454 焦磷酸測序、SOLiD 連接法測序、Illumina 合成測序（Solexa 測序、Hiseq 測序）以及宏基因組等組學技術。該方法能在完成大曲基因組學測序和注釋的同時，一定程度上解析功能基因組，極大地促進了非培養微生物多樣性及群落結構等研究的進展。大曲酶系的研究在初期主要集中于化學檢測法和高效液相色譜法（HPLC）分析大曲粗酶液以及自大曲分離的純菌所產粗酶的酶學性質，而后采用宏轉錄組等組學技術檢測大曲酶系種類，以揭示大曲活躍微生物和酶譜。如今大曲酶系研究的難點主要體現在大曲宏轉錄組和宏蛋白組提取時容易降解、難以完全獲取以及來源于大曲的酶基因在不同表達系統中實現異源表達得到純酶兩個方面。

大曲按其制曲溫度可分高溫大曲、中溫大曲和低溫大曲，代表曲分別是為醬香型大曲、濃香型大曲以及清香型大曲。目前濃香大曲酒占據了70% 白酒市場份額［4］，為當地經濟的發展做出了重要的貢獻。因此，本文將從菌系、酶系以及它們在大曲中的應用這3 個方面來闡述濃香型大曲的研究進展。

1 大曲微生物——菌系

濃香型白酒微生物的分離篩選始于20 世紀60 年代［5］，起初利用純培養方法分離、篩選、鑒定濃香型大曲中的微生物菌種，并簡單研究其生理代謝功能。隨著技術的進步，又采用PCR-DGGE、454 焦磷酸測序、Illumina MiSeq以及宏基因組學等技術對微生物的種類、數量、分布以及動態變化進行研究。

早在1995年，唐玉明等［6］就采用純培養方法從瀘州老窖大曲分離到酵母菌、霉菌、細菌以及芽孢桿菌。而后，祝云飛等［7］人采用Biolog 技術來鑒定基于純培養得到休哈塔假絲酵母。目前使用較多的方式，是將傳統純培養和頂空固相微萃取氣質聯用（HS-SPME-GC-MS）等新技術相結合研究大曲微生物，在一定程度上追溯濃香型大曲酒感官風味的來源。明紅梅等［8］采用純培養方法從濃香型大曲篩選出地衣芽孢桿菌和異常威克漢姆酵母等產濃郁香氣的菌株。經HS-SPME-GC-MS 檢測，兩株菌產生的香味物質，如2,3,5-三甲基吡嗪等，皆是濃香型大曲香味的重要組成成分。大曲中的香味物質主要來源于細菌和酵母菌，對這些風味產生菌進行研究，能做到感官風味的溯源以及產香菌株的性能優化。由于白酒是地域性很強的產品，溯源其風味物質不僅有利于提高大曲質量，還有利于在異地重現名優酒品質和風味。

純培養分離方法具有耗時長、效率低，且只能分離篩選一部分可培養微生物等缺點，于是各種非培養方式被不斷地用于濃香型大曲微生物的研究。如表1 所示，葉光斌等［9］與Yan 等［10］采用PCR-DGGE 技術分析了大曲生產過程中細菌和真菌群落的多樣性；Huang 等［11］采用454 焦磷酸測序技術分析了濃香型大曲高溫制曲階段微生物的多樣性和豐富度；Wang 等［12］采用Illumina MiSeq技術分析了濃香型大曲中的好氧菌、兼性好氧菌；Yang等［13］采用Illumina MiSeq技術分析了不同時期菌的優勢菌群；Wang 等［14］采用高通量測序分析得到了大曲優勢菌群的種類；翟磊等［15］采用宏基因組學測得不同來源的大曲微生物種群，并比較了其差異性。PCR-DGGE和現代高效測序技術應用于大曲，能更加高效、全面地解析濃香型大曲微生物的多樣性、群落結構及代謝功能［16-17］，揭示大曲制備過程中微生物的消長規律，證實大曲中各菌群之間緊密而復雜的代謝關系。相較于純培養方法只能分離純化部分大曲可培養微生物的種類，采用非培養方法中的測序技術既能系統高效地了解濃香型大曲不同階段微生物的多樣性和豐富度，打破慣性認知；又能準確得知微生物的代謝途徑和產物；還能發現許多未知菌種，極大地豐富了濃香型大曲微生物數據庫。采用非培養方式研究濃香型大曲中微生物群落多樣性的做法固然高效全面，但是也并非沒有缺點，如大曲中的乳球菌、鏈球菌、產芽孢桿菌等能夠通過傳統微生物手段純化分離，但是PCR-DGGE 無法檢出［18］。所以，對濃香型大曲中微生物菌落的多樣性進行研究，最好是采用兩種或者兩種以上的檢測手段，以保證試驗結果的系統性、全面性和可靠性。

表1 濃香型大曲菌系的研究

濃香型大曲菌系龐大而復雜，且菌系的種類和數量影響著酶系和化合物的產生，直接決定大曲酒的酒質。非培養微生物的研究利于全面了解大曲微生物的種類、分布及其發酵機理，具有重要的研究意義；可培養微生物的研究則有利于從大曲中篩選到許多可應用于白酒釀造或更多行業的優良菌系，具有很強的現實意義。所以，在利用測序技術得到的微生物信息研究大曲發酵機理的同時，將高性能的可培養微生物進行篩選、鑒定，乃至研究其應用性，是目前研究大曲微生物較為全面的一種方式。

2 大曲酶系

酶是由生物細胞產生的、具有高度催化活性的蛋白質，一切微生物的生命活動都離不開酶［19］。濃香型大曲中多種微生物混合發酵，產生大量酶系才能滿足大曲酒的釀造需求，其主要酶系有：淀粉酶、蛋白酶、氧化還原酶、纖維素酶、單寧酶、木聚糖酶、果膠酶、裂解酶、異構酶等［20］。各種酶系在白酒釀造中起到舉足輕重的作用：如淀粉酶能將原料中分子量較大的淀粉分解成小分子的糖為酒精發酵奠定物質基礎；蛋白酶能水解蛋白質產生氨基酸，并為微生物生長繁殖提供所需的營養物質；纖維素酶能水解植物細胞壁、釋放胞內淀粉，提高出酒率；脂肪酶分解脂肪為微生物提供能量，為大曲酒的香味組成提供前體物質等。

糖化力和液化力是評價大曲質量的重要指標。最初對大曲酶系的研究，主要是采用傳統化學法檢測其糖化力和液化力。由于白酒行業的快速發展，傳統方法因耗時長、效率低、試驗結果精確度差等原因，逐漸不能滿足大曲質量檢測需求，所以引進新的檢測技術就成了必然的選擇，見表2。張強等［21］先用直接滴定法和比色法測定不同品牌大曲酶提取液的糖化力和液化力，再用高效液相色譜法（HPLC）對提取液中酶的反應產物進行分析，并計算其酶活力。研究表明，兩次檢測結果一致，證實了HPLC適用于分析大曲糖化力與液化力。

表2 濃香型大曲酶系的研究

對篩選到的特定功能菌所產粗酶的研究主要體現在利用純培養的方法自大曲中分離篩選能分泌α-淀粉酶、蛋白酶、酯化酶等不同功能酶的菌株，分析其酶學性質。衛春會等［22］從濃香型大曲中分離到一株產蛋白酶活性較高的菌株，分析了其酶學性質以了解該酶的最適反應條件包括pH、溫度、金屬離子對該酶的影響機理。王玉霞等［24］測定了整個大曲制作過程中α-淀粉酶、單寧酶、木聚糖酶和脂肪酶酶活變化，以及產酶菌種的多樣性，分析大曲曲皮、曲心的酶活變化。對特定功能酶進行分析，有利于后期進行分離純化以及條件優化，提高功能酶的產量。而對不同時期的功能酶酶活變化進行研究，不僅有助于篩選特定功能酶產生菌，還能研究其酶學性質，為制備強化大曲和純酶制劑打下基礎。

近年來，主要通過組學技術全面研究大曲功能酶的數量、種類以及相應的作用機理。Huang 等［28］首次分析了濃香型大曲宏轉錄組，全面闡述了大曲活躍微生物的結構組成和代謝特點，證實耐熱真菌是主要活躍微生物；其次挖掘了有關糖酵解、淀粉水解、丙酮酸代謝和乙醇代謝等代謝通路的關鍵酶；最后還證實了檸檬酸循環所產生的代謝產物是形成大曲風味的關鍵。Wang等［14］采用宏蛋白組學技術對濃香型大曲進行研究，確定了乳桿菌、曲霉、畢赤酵母、釀酒酵母和根霉是宏蛋白的主要來源。組學技術應用于濃香型大曲微生物代謝功能的研究，有利于后期白酒質量的優化以及更多有價值酶的挖掘。但是由于大曲樣本多糖含量高和發酵產物復雜等原因，樣品RNA 和蛋白的提取十分不穩定，極大地限制了組學技術在大曲方面的應用。

以上例子是大曲粗酶和組學方面的分析，展示了大曲酶的豐富種類與籠統的酶學功能，均未能清晰深入揭示大曲特有功能酶的酶學價值。目前來說，關于大曲特有功能酶系較為熱點的研究是將來源于大曲的酶基因連接到不同的表達體系上，通過異源表達得到特定的純酶，進而精確分析大曲特有酶的酶學特性。Yi 等［29］和Barkat 等［30］分別將基于宏轉錄組學得到的濃香型大曲中耐高溫α-淀粉酶基因和β-葡聚糖酶基因，在畢赤酵母X33 和大腸桿菌中進行異源表達，得到了耐高溫且熱穩定性更好的α-淀粉酶純酶和β-葡聚糖酶純酶。基于宏轉錄組學的結果，可以從濃香型大曲中獲得更多無法通過純培養方法獲取的不同功能的酶基因，并通過異源表達得到純酶，研究它們在釀造過程中可能起到的協同作用。

長期以來，大曲酶系的研究都集中于大曲粗酶液和大曲來源微生物發酵粗酶液這兩個方面，這些領域的研究有助于識別大曲中的主要酶系。首先大曲存在“一菌產多酶”、“一酶來自于多菌”的現象，對大曲粗酶液進行研究，利于功能酶產生菌的溯源及篩選。其次大曲中還有多種酶系來源于不可培養的微生物，利用現代組學技術獲得其酶基因，通過異源表達得到純酶，是大曲研究過程中取得的重大進步。然而無論是通過篩選功能酶產生菌獲得的粗酶，還是通過異源表達獲得的純酶，若能研究、改進其酶學性質，通過單酶或復配手段真正應用于白酒生產，進一步提高白酒出酒率和酒質，對于白酒行業來說，都具有積極意義。

3 菌系、酶系在濃香型大曲中的應用

3.1 菌系

強化大曲是指通過人工接種純種菌（如酵母菌、霉菌、酯化菌），在生產中能起到減少大曲的用量、提高淀粉利用率、糧食出酒率以及成品酒酒質的效果。自1982年起，田以清等［31］就制備出糖化力、發酵力都較高的強化大曲投用于生產。近年，楊躍寰等［32］從瀘州老窖大曲中分離純化得到棒曲霉和黑曲霉兩株高產菌株并應用于大曲生產，發現大曲糖化力較穩定，且能在不影響大曲風味的情況下增加曲香（見表3）。總的來講，適用于制備強化大曲的菌種都有長處和短板，例如：生香活性干酵母的發酵力很低，但能有效提高白酒中總酯和乙酸乙酯的含量；產酒精酵母的發酵力強，但酯化力通常很差。所以各菌種通常要進行復配使用，才能達到提高出酒率和感官風味的作用。陳雪玲等［33］研究發現，合適的復合菌劑能夠在不改變大曲酸度的情況下，提高大曲糖化力、液化力、發酵力以及轉化己酸乙酯的能力，豐富白酒的感官風味。謝國排等［34］從金種子濃香型大曲中分離出6 株產蛋白嗜熱細菌，皆能產生不同的芳香族化合物、酚類、酯類等物質，不同菌株復配制成的強化大曲功能各有不同。柯濤等［35］采用氣質聯用（GC-MS）的方式對從糟培中篩選出的產香細菌進行分析，并接種最佳比例的復合菌劑應用于生產，發現其感官風味和理化性質都優于原大曲，而且頂火期持續時間也更長，有望賦予濃香型大曲部分醬香味，改善濃香型白酒的香味成分組成。

除了制備強化大曲，還可以通過改進制曲工藝提高大曲的質量。夏嶼等［36］采用實時定量基因擴增熒光檢測系統（qPCR）和高通量測序技術，分析比較熱風干燥與自然干燥兩種不同的處理方式下大曲真菌群落的變化差異。研究發現熱風干燥有利于假絲酵母屬生長，對排潮期大曲有積極意義，有助于改進傳統制曲工藝，提高大曲質量。

大曲中的化合物不僅影響著菌系的物種多樣性和豐富度，還起著投糧、豐富大曲酒感官風味的作用。化合物比例失調會在很大程度上影響大曲酒的感官風味，而在實際生產中通過調整菌種的豐富度，可以達到提高或降低大曲中某些化合物含量的目的，如通過酵母菌和乳酸菌的拮抗作用降低乳酸乙酯的含量。生產乳酸乙酯的前體物質是乳酸菌產生的乳酸以及酵母菌產生的乙醇，二者再通過酯化酶的作用生產乳酸乙酯。乳酸乙酯作為濃香型白酒重要的風味物質，它的比例是否恰當在很大程度上影響著原酒乃至成品酒的感官風味和質量［37］。濃香型白酒長期以來都存在著乳酸乙酯含量過高的情況［38］，“増己降酸”一度是眾多酒廠關心的問題。羅青春等［39］從糟培中分離得到優勢酵母菌和乳酸菌株，兩株菌分別抑制對方生長，又相互作用生成乳酸乙酯。因此，在大曲培菌期適當引導酵母生長、減緩乳酸菌增殖，有助于降低乳酸乙酯含量。宋克偉等［40］從大曲中分離篩選到1 株枯草芽孢桿菌，通過試驗可知該菌株能高效降解白酒中乳酸乙酯的含量，降解率高達20%。楊望軍等［41］自大曲和酒醅中分離篩選到降解乳酸能力較強的解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌各1 株。模擬發酵結果發現解淀粉芽孢桿菌降解乳酸能力為25.97%，枯草芽孢桿菌降解乳酸能力為38.54%。

3.2 酶系

酶系在大曲中的應用不多，主要包括固定化酶和純酶制劑的應用。固定化酶的應用在釀酒過程中較常見的是將糖化酶和液化酶固定在載體上，直接通過復配應用于生料釀酒，可以跳過釀酒原料蒸煮糊化的過程［42］。純酶制劑在釀酒過程中的作用主要體現在降解原料中的纖維素，提高糖化力、出酒率以及酒質等方面。釀造白酒所用的原料都含有較多的纖維素，適量添加纖維素酶有利于破壞間質細胞壁的結構，釋放淀粉。李旭暉等［43］將纖維素酶應用于大曲固態發酵過程（表3），試驗結果表明：當纖維素酶添加量為0.005%（10 FPU/kg 酒糟），可將出酒率提高1 倍；當纖維素酶添加量為30 FPU/kg~50 FPU/kg（糟），所產白酒感官風味更突出，酒質更好。雜醇油是白酒主要香味成分之一，但含量過高會影響白酒的澄清度、降低酒質。孫金旭等［44］將酵母、糖化酶、蛋白酶、大曲等按比例復配，試驗結果顯示當蛋白酶含量適當時，可以明顯抑制雜醇油的生成量。純酶制劑也常通過復配再應用于大曲。阿米諾酶是白酒釀造中常用的復合酶制劑，包含根霉、曲霉、毛霉等多種性能優良的菌株產生的復合粗酶［45］。阿米諾酶作為一種工業酶制劑，不僅能糖化和發酵淀粉質原料，還具有耐高溫和耐酸的性能。將阿米諾酶應用于濃香型大曲酒的生產以及雙輪底工藝，不但能減少用曲量、提高出酒率，還能促進生香和提高酒質。

表3 菌系、酶系在濃香型大曲中的應用

4 結束語

濃香型大曲中菌系、酶系的數量和種類，決定著白酒的出酒率、酒質及風味。對大曲菌系、酶系進行研究，有利于更深層次地揭示大曲的發酵機理，還能在一定程度上推動白酒釀造行業的發展。之前由于技術限制以及認知不完全，只能簡單篩選某些可培養微生物，粗略研究其酶學性質及代謝產物，并不能完全、深刻地闡明大曲的發酵機理。而如今，將新一代測序技術和組學技術（包括風味組學、基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學）相結合，研究大曲菌系、酶系的變化以及它們的關聯性，有利于分析微生物群體的種類、進化和體外功能代謝，有利于全面了解大曲酶系的組成和調控機理。但由于大曲樣本的復雜性，以及現有的科技瓶頸，只能得到可培養微生物和非培養微生物的群落多樣性和部分群落功能。如果能將宏基因組、宏轉錄組與宏蛋白組結合，便能完善宏基因組和宏轉錄組的不足，在核酸分析的基礎上對微生物表達蛋白進行分析，能夠更好地解釋濃香型大曲微生物的遺傳和功能。在現代化的理論和科技支撐下，濃香型大曲微生物的群落結構、多樣性以及代謝通路將會得到更清晰、更全面地闡述，新的功能酶將會被更多地挖掘并應用于大曲酒釀造，白酒固態發酵機理的解析必然會更加全面和透徹，并最終使得白酒固態發酵效率和品質進一步提升。