蒙藥藍刺頭對去卵巢大鼠TGF-β1、BMD及子宮組織形態的影響*

趙 軍，李 昕，劉 晉，王雄耀，師建平△，董重陽，常 虹，高小明，莫日根，謝靜華

1內蒙古自治區中醫醫院，內蒙古 呼和浩特010020；

2內蒙古醫科大學附屬醫院；3內蒙古醫科大學中醫學院

原發性骨質疏松癥按照其成因可分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型骨質疏松癥由于雌激素缺乏而多發生于絕經后5～10年的女性，所以也叫絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）。雌激素替代療法（estrogen replacement therapy，ERT）防治該疾病費用昂貴，易出現高血凝狀態、高血壓、水腫等副反應，且長期使用可增加子宮癌及乳腺癌的發病率［1］。為此，人們在致力于尋求雌激素替代物，這類物質被稱作選擇性雌激素受體調質，而植物雌激素正是其中之一。流行病學調查發現，人類激素相關性疾病低發區與食富含植物雌激素的人群成正比，且植物雌激素副作用較小，對圍絕經期綜合征、心血管疾病及骨質疏松有保健和治療作用［2］。研究顯示［3-4］，蒙藥藍刺頭具有植物刺激素樣作用，可通過雌激素樣作用促進骨形成，骨吸收、降低骨轉換率，延緩絕經后骨量丟失的發生發展，以此達到防治PMOP的作用。本研究就藍刺頭對去卵巢大鼠血清轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、骨密度（bone mineral density，BMD）、子宮組織病理學變化的影響進行研究，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器蒙藥藍刺頭制劑由廣州中醫藥大學技產業園有限公司提供，產地：新疆烏魯木齊市天山區；采摘時間：2018年7月。強骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司，批號：20181103，規格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久聯制藥有限公司，批號：20181004，規格：0.5 mg/片）。TGF-β1ELISA試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；蘇木素-伊紅染液；5%堿性美藍溶液；亞甲基藍染液；PBS緩沖液；鹽酸；氨水；酒精。JA503型1/1 000電子稱（凱豐集團有限公司）；ACS-H1型電子計重稱（上海海康電子儀器廠）；低速離心機（北京醫用離心機廠出品，3000 r/min）；冰箱（內蒙古醫科大學病理學實驗中心提供）；SZX19型Olympus顯微鏡（100倍，日本奧林巴斯公司）；圖像分析儀（清華同方Motic Image Advanced 3.0）；Micro-CT（內蒙古醫科大學附屬醫院實驗研究中心）。

1.2 實驗動物4月齡雌性Wistar大鼠，77只，平均體質量（250±20.00）g，購于內蒙古大學實驗動物研究中心，動物實驗合格證號：SCXK（蒙）2002-0001。內蒙古醫科大學基礎實驗樓病理學實驗室，大鼠為清潔級，飼養條件一致，標準飼料喂養，恒溫、恒濕，室溫（25±3）℃，空氣濕度55%～65%，自然光照、通風良好、自由進食水，養于專用鼠籠內，每籠11只，購回適應環境7天左右。

1.3 分組與造模將77只大鼠隨機平均分為藍刺頭高、中、低劑量組，強骨膠囊組，乙烯雌酚組，模型組，假手術組7組，每組用亞甲基藍染液分別編號1～11。絕經后PMOP模型的復制參考文獻［5］進行，假手術組不切卵巢只切除卵巢周圍少量脂肪，造模縫合創口后5天，將大鼠陰道脫落細胞涂片［6］進行觀察。假手術組大鼠陰道涂片充滿有核細胞、白細胞和角質化細胞，而PMOP模型組中很少見上述細胞，表明造模成功。見圖1。

圖1 光鏡下雌鼠陰道涂片（HE×400）

1.4 給藥及處理正常飼養90天后進行藥物干預灌胃給藥。藍刺頭高、中、低劑量組依據人、鼠體質量比例及人、鼠代謝速率比折算后分別以27.500 0、13.750 0、6.875 0 mg/mL的劑量灌胃給藥，以低劑量組為臨床等效劑量。強骨膠囊23.437 5 mg/mL，己烯雌酚0.031 3 mg/mL，均按成人劑量的有效量給藥；用相應體積的0.9%氯化鈉溶液對模型組和假手術組進行灌胃。為了便于方便配藥，換算為按大鼠體質量灌胃0.02 mL/（g·d），配制成相應的濃度。灌胃過程中每組死亡2只。處死前1天停止給食，處死時腹腔注射10%水合氯醛0.8 mL麻醉，然后心內取血，采血約6～10 mL離心管內，采用3000r/min離心5 min后分離血清，進行血清TGF-β1，檢測；處死大鼠剖取雙側完整股骨，分離干凈附著的肌肉組織，保留完整骨膜，將股骨標記清楚，將右側股骨用來測定離體BMD水平；大鼠子宮用4%甲醛溶液浸泡，室溫保存10天，HE染色觀察。

1.5 觀察指標

1.5.1 骨組織計量學測定 采用顯微CT對所有大鼠右側股骨BMD計量學指標進行分析。

1.5.2 測定血清TGF-β1水平 采用酶聯免疫法檢測血清TGF-β1表達水平，實驗步驟完全按TGFβ1試劑盒說明書操作步驟進行。

1.5.3 子宮病理學觀察 常規包埋、HE染色。每組大鼠取5張切片（n0），每張切片隨機選擇5個視野（n1），在光學顯微鏡下觀察各組染色情況，采用醫學圖像分析系統，測定鏡下細胞：1）子宮內膜上皮細胞高度；2）子宮內膜腺上皮細胞高度；3）腺腔內徑；4）宮內膜腺體面積百分比；5）肌全層。

1.6 統計學方法采用SPSS 13.0統軟件計進行數據統計分析，計量資料用±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨組織計量藍刺頭中劑量組，乙烯雌酚組，強骨膠囊組，假手術組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；藍刺頭高、低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藍刺頭高、低劑量組與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、假手術組、強骨膠囊組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BMD水平比較（±s） g/cm

表1 各組大鼠BMD水平比較（±s） g/cm

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與假手術組比較，P＜0.05

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2.2 血清TGF-β1水平大鼠血清TGF-β1模型組與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；藍刺頭中劑量、己烯雌酚組、強骨膠囊組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；藍刺頭高、低劑量組與模型組比較，無明顯差異（P＞0.05）；藍刺頭高、低劑量組與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、強骨膠囊組、假手術組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TGF-β1水平比較（±s）ng/mL

表2 各組大鼠血清TGF-β1水平比較（±s）ng/mL

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與假手術組比較，P＜0.05

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2.3 大鼠子宮病理學變化大鼠子宮全肌層觀察結果顯示：假手術組內膜層較去卵巢組厚，內膜內腺腔明顯，全肌層明顯增厚，細胞飽滿，排列致密。模型組子宮較假手術組明顯縮小，內膜層薄，內膜上皮及腺體上皮較假手術組明顯變薄，腺腔直徑較假手術組縮小甚至不明顯，全肌層明顯變薄，細胞縮小，排列松散。見圖2。

圖2 假手術組、PMOP模型組大鼠子宮各部位病理學變化（HE×400）

子宮內膜上皮細胞高度、子宮內膜腺上皮細胞高度、腺腔內徑、宮內膜腺體面積百分比，假手術組、藍刺頭中劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組與藍刺頭高、低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；藍刺頭高、低劑量組與模型組比較，無統計學差異（P＞0.05）；藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠子宮各項指標比較（±s）

表3 各組大鼠子宮各項指標比較（±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與假手術組比較，P＜0.05

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3 討論

骨質疏松癥屬蒙醫經典文獻中“骨枯癥”范疇。蒙醫理論認為，骨在五元中屬于土，是“赫依之寓所”，也是“赫依”病變串行之道，易發生骨折等的原因為氣血相搏、精華與糟粕分解功能減弱，“腎氣虛弱，精華不足”是骨質疏松癥主要病機。

研究顯示，蒙藥藍刺頭有植物雌激素樣作用，可通過雌激素樣作用而促進骨形成，調節骨吸收與骨形成的偶聯，降低骨轉換率，達到防治PMOP的目的［7-8］。藍刺頭可通過降低去卵巢大鼠的骨高轉換率，抑制骨吸收，調節骨吸收-骨形成偶聯，防止骨量快速丟失，以延緩絕經后骨量丟失的發生發展，以此達到防治PMOP的目的［4］。TGF-β1作為在骨基質內含量最高的細胞因子，對骨重建發揮重要作用。它能促進骨細胞的增值分化及細胞外基質的合成，并促使成熟的破骨細胞發生凋亡［9］。子宮質量、組織形態變化是體內雌激素變化最靈敏的指標，還表現在雌性大鼠的陰道上皮角化等。BMD是診斷骨質疏松的“金標準”。

本實驗中，大鼠血清TGF-β1、BMD、子宮組織病理學變化，藍刺頭中劑量組在BMD、TGF-β1及子宮病理性改變上與強骨膠囊組，乙烯雌酚組及假手術組相當。說明藍刺頭適當的劑量能有效防治因雌激素減少而導致的骨質疏松，提高血清TGF-β1及BMD水平，在骨組織形態學結構變化上，藍刺頭防治絕經后骨質疏松大鼠模型是有效的，治療效果與強骨膠囊、己烯雌酚相似。因此，蒙醫“骨枯癥，補暖補精，補腎固骨質壯骨”理論與經典的雌激素通路具有密切聯系，此通路是蒙醫抗骨質疏松基礎理論在現代醫學實踐中的重要組成部分。

綜上所述，本研究為藍刺頭蒙醫“腎主骨，治以補暖補精”理論防治PMOP提供了實驗依據，但其詳細的機制還需要進一步研究。