八角葉片中油細胞的形態、分布與季節變化

黃開順，曾祥艷，梁文匯，李開祥，廖健明，王 坤

（廣西壯族自治區林業科學研究院 國家林業和草原局八角肉桂工程技術研究中心 廣西木本香料工程技術研究中心 廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室，廣西南寧 530002）

八角（Illicium verum）為八角科（Illiciaceae）八角屬常綠喬木[1]。黃卓民[2]以花色為主要依據，把八角劃分為紅花八角、淡紅花八角、白花八角和黃花八角4個品種類群。八角作為栽培歷史悠久的香料兼藥用樹種，主要分布在廣西、云南和廣東的南亞熱帶丘陵山地，其中廣西是世界上最大的八角產地，被譽為“世界八角之鄉”[3-5]。

八角的主要利用部位為果實和枝葉。果實干燥后既是常用的調料，也是一種傳統中藥材。果實和鮮葉還可提取揮發油，鮮葉出油率1%左右，干果出油率10%左右，獲得的油產品俗稱茴香油、茴油或八角油[6-7]。茴香油經分離加工和提純可獲得茴腦、草蒿腦和芳樟醇等單離成分[8]，這些成分在食品工業上可用于調制和合成各種香精香料，在日化用品工業上可作為香水、香皂和牙膏等生活用品的加香劑。果實還含有某些有效成分和活性物質，可作為制藥原料，比如莽草酸可用于生產抗禽流感病毒藥物[9-11]。八角粉或茴香油還可用于生產飼料添加劑[12]和抗菌保鮮劑[13]。八角既有較高的經濟價值，又有良好的水土保持生態價值[14]。

植物各細胞的生長發育及其形態具有季節性變化。石江濤等[15]研究發現，構樹（Broussonetia pa?pyrifera）次生韌皮部細胞的形態、尺寸、數量和分布在生長季節內有動態變化，呈現明顯的季節差異。植物油細胞是一種異形細胞，屬于分泌組織，細胞內含揮發油[16-17]。八角葉片中揮發油的產生、積累和揮發與油細胞的發育有直接關系，油細胞的形態和數量影響出油率。有關八角葉片中油細胞的形態、分布及其季節變化研究尚未見報道。紅花八角是生產中栽培最廣泛、品質和產量較高的主栽品種類群之一[18]。本研究以紅花八角鮮葉為材料，采用石蠟切片和顯微觀察的方法，分析葉片中油細胞的形態、分布和季節動態變化規律，及其與氮、磷、鉀和硼營養元素含量的相關性，以期為八角油細胞發育規律的進一步研究及茴香油資源的開發與利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

八角鮮葉采自廣西壯族自治區林業科學研究院八角種質資源收集圃（108°21'E，22°55'N），位于廣西南寧市北郊，年均氣溫21.8 ℃，年均降水量1 300 mm，地貌為低丘，海拔95 m[19]。八角樹齡為12年，按常規措施進行施肥管理。選擇10株八角作為定期采樣對象，均屬于不同株系。按照春（3～5月）、夏（6～8月）、秋（9～11月）和冬（12～2月）4 個季節，于2017年7月、10月及2018年1月、5月和8月采集八角鮮葉樣品5批次。每次在每株樹冠向陽部位采摘健康成熟葉片5 張作為石蠟切片材料，采摘后放入保鮮袋，盡快帶回實驗室進行固定處理。每株采摘300 g 鮮葉用于氮、磷、鉀和硼營養元素含量的測定。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片制作

采用常規的石蠟制片方法[20]。取八角葉片中部至邊緣的一部分，用刀片橫切葉片，切取約1 cm2的葉片組織（帶主脈），放入FAA 固定液，浸泡24 h 以上。將葉片組織從固定液中取出，用酸性軟化液軟化，之后依次放入75%酒精4 h、85%酒精2 h、90%酒精2 h、95%酒精2 h、無水乙醇I 2 h、無水乙醇II 2 h，逐級徹底脫水，二甲苯透明，石蠟滲透包埋；采用Leica RM2245 石蠟切片機（上海，中國）橫切成厚度4～10μm 的切片，脫蠟至水，番紅-固綠染色，之后依次放入無水乙醇Ⅰ30 s、無水乙醇Ⅱ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min，脫水透明，晾干，中性樹膠封片保存。

1.2.2 顯微觀察與測定

采用Olympus CX32 顯微鏡（中國，廣州）及其TOPVIEW 成像系統觀測石蠟切片中的油細胞并拍照。每株八角選取1張石蠟切片，觀測葉片厚度和5個視野的油細胞數據，統計每個視野所見油細胞數量及單個油細胞直徑，油細胞直徑取油細胞視面垂直兩個方向長度的平均值。觀測和統計完成后，計算油細胞的大小和分布密度。顯微鏡視野長度固定為720μm。

1.2.3 營養元素含量測定

將每批次鮮葉樣品帶回實驗室進行營養元素含量測定，采用常規方法測定全氮、全磷、全鉀和全硼的含量[21-23]。

1.3 數據處理

用于季節變化分析的油細胞大小和密度及葉片全氮、全磷、全鉀和全硼含量均取10株的平均值。采用Excel 2010 軟件進行數據處理和作圖，采用SPSS 22.0 軟件進行方差分析[24]。分析葉片營養元素含量、油細胞大小和油細胞密度隨季節變化的相關性時，采用SPSS 22.0軟件進行連續變化雙變量相關分析，計算Pearson相關系數[25]。

2 結果與分析

2.1 八角葉片中油細胞的分布和形態特征

葉肉組織中的油細胞主要分布在柵欄組織和海綿組織中，葉肉中部區域分布較少（圖1）。靠近上表皮的柵欄組織中油細胞較多，靠近下表皮的海綿組織中油細胞較少。除了葉脈間的葉肉組織，各級葉脈組織中也有較多油細胞。

圖1 八角葉片橫切面圖Fig.1 Transverse section of I.verum leaves

油細胞的外觀形態不規則，形狀各異，大小不一。在柵欄組織中，油細胞與旁邊柱狀細胞緊密豎排，由于被緊密排列的柱狀細胞夾住，油細胞多呈柱形、棒形或近橢圓形。在海綿組織中，各種細胞排列疏松，油細胞多呈近圓形、半圓形或扇形，并無統一或較一致的形狀。從油細胞大小看，柵欄組織中的油細胞明顯大于海綿組織中的油細胞。在葉脈組織中，油細胞呈近橢圓形，大小不一。

在柵欄組織和海綿組織中，發育成熟的油細胞一般處于完全液泡化的狀態，細胞質和細胞核不明顯或解體，液泡幾乎充滿細胞腔，整個細胞呈貯油囊狀。葉脈組織中多見未充分液泡化的油細胞，細胞內的液泡貯油囊沒有膨脹至細胞壁，液泡周圍的細胞質仍明顯可辨。

2.2 八角葉片中油細胞大小的季節變化特征

八角株系間，除春季柵欄組織和秋季海綿組織的油細胞大小外，其他季節的油細胞大小均差異顯著（P< 0.05）（表1）。隨著季節的變化，八角葉片中油細胞的大小有波動變化，柵欄組織和海綿組織中油細胞大小的季節波動方向和幅度有一定差異（圖2）。在柵欄組織中，油細胞大小的波動幅度較大，呈現出明顯的“升-降-升”變化趨勢，平均值為3 271.39 μm2；夏季到秋季明顯上升，在冬季達到峰值（4 002.65 μm2），之后明顯下降。在海綿組織中，油細胞大小的波動幅度較小，平均值為1 803.88μm2。

圖2 八角葉片中油細胞大小的季節變化Fig.2 Seasonal variation of oil cell size in I.verum leaves

2.3 八角葉片中油細胞密度的季節變化特征

八角株系間，各季節葉片橫切面油細胞密度均差異顯著（P<0.05），說明由于個體差異，葉片中油細胞密度變異大（表1）。

表1 不同季節八角葉片中油細胞大小和密度的方差分析Tab.1 Variance analysis on oil cell size and density in I.verum leaves in different seasons

隨著季節的變化，八角葉片橫切面油細胞密度發生較明顯的波動變化，柵欄組織和海綿組織中油細胞密度的季節波動方向一致，均呈現出“降-升-降”的變化趨勢（圖3）。柵欄組織中油細胞密度的波動幅度較大，有急降急升的變化特征，平均值為16.29 個/mm2，夏季到秋季油細胞密度明顯降低，冬季又明顯上升。海綿組織中油細胞密度的波動幅度較小，平均值為6.47個/mm2。

圖3 八角葉橫切面油細胞密度的季節變化Fig.3 Seasonal variation of oil cell density in transverse section of I.verum leaves

2.4 營養元素含量分析

八角的生長發育需要各種營養元素，其葉片中油細胞的形成、發育以及揮發物的積累與營養元素存在一定關系。

為探索營養元素含量與油細胞大小和密度的相關性，在顯微觀察油細胞形態和分布的過程中，分析葉片中全氮、全磷、全鉀和全硼含量的動態變化過程。八角葉片中的全氮含量呈現平緩的“升-降-升”變化過程，全磷含量呈現平緩的持續上升變化過程，全鉀含量呈現平緩的“降-升-降-升”變化過程，全硼含量呈現“急升-緩降-急升”的變化過程（圖4～5）。

圖4 八角葉片中全氮、全磷和全鉀含量的季節變化Fig.4 Seasonal variations of contents of total nitrogen,total phosphorus and total potassium in I.verum leaves

圖5 八角葉片中全硼含量的季節變化Fig.5 Seasonal variation of total boron content in I.verum leaves

2.5 八角葉片中油細胞大小、密度和營養元素含量的相關性

油細胞大小與密度均呈負相關，說明葉片中油細胞個體越大，其分布密度越低。油細胞大小與全氮、全磷、全鉀和全硼含量均呈正相關，海綿組織中的油細胞大小與全硼含量呈顯著正相關（P<0.05）（表2）。油細胞密度與全氮、全磷和全硼含量均呈負相關，與全鉀含量呈正相關，柵欄組織中的油細胞密度與全氮含量呈顯著負相關（P<0.05）。

3 討論與結論

八角葉片中的油細胞主要分布在脈間區的柵欄組織和海綿組織中，葉脈組織中也有分布；柵欄組織中分布最多，分布位置多靠近上表皮細胞，油細胞個體較大。這一結果與一些樹種的研究結果一致。周存宇等[26]觀察了楠屬（Phoebe）5 種植物葉片中的油細胞，發現油細胞均分布于柵欄組織，且靠近上表皮；蔡霞等[27]觀察了木蘭科（Magnoliaceae）82 種1 亞種植物葉片中的油細胞，發現油細胞在葉肉中的分布有3種情況，包括主要分布于柵欄組織、主要分布于海綿組織和均勻散布于整個葉肉。油細胞分布于柵欄組織是許多芳香植物常見的一種性狀。

八角葉片柵欄組織和海綿組織中的油細胞一般都發育至液泡化，呈貯油囊狀，原有的細胞質解體消失。許多研究表明，液泡化是芳香植物油細胞發育成熟的共同特征。侯佳等[28]和初慶剛等[29]分別研究了姜花（Hedychium coronarium）和油樟（Cinna?momum longepaniculatum）油細胞的發育過程，均發現最初油細胞內部產生多個小液泡，之后小液泡融合成大液泡，細胞質被擠壓縮小并逐漸解體，液泡逐漸膨大至充滿整個細胞內部，形成一個大的貯油囊，開始積累油狀物。

八角葉片中油細胞的大小和密度均隨季節變化而變化，且株系間差異顯著，這種差異性為高含油八角品種的選育提供了基本條件。孫婭東[30]研究表明，芳樟（C.camphoravar.linaloolifera）同家系單株間葉片中的油細胞形態存在差異，油細胞大小的差異性較油細胞密度大；不同月份間油細胞密度存在差異，有季節性變化，與八角葉片中油細胞的性狀相似。

八角葉片中油細胞的形狀不規則，柵欄組織中的油細胞呈柱形、棒形或近橢圓形，海綿組織中的油細胞呈近圓形、半圓形或扇形，這兩種組織中成熟的油細胞一般充分液泡化；葉脈組織中的油細胞多呈近橢圓形，一般未充分液泡化。葉片柵欄組織、海綿組織和葉脈組織中均有油細胞存在，柵欄組織中較多，其分布位置多靠近上表皮細胞，油細胞個體較大。不同株系間油細胞的大小和密度差異顯著。油細胞的大小和密度隨季節發生變化。柵欄組織中油細胞大小和密度的季節變化幅度較大，平均值分別為3 271.39 μm2和16.29 個/mm2；海綿組織中油細胞大小和密度的季節變化幅度較小，平均值分別為1 803.88 μm2和6.47 個/mm2。冬季時，油細胞大小和密度均處于較高狀態，在此季節制取茴香油較佳。

八角葉片中油細胞的大小與密度呈負相關，表現出油細胞個體越大、分布密度越小的特征。海綿組織中油細胞大小與葉片全硼含量呈顯著正相關，說明葉片吸收和積累硼，可能會促進油細胞個體的生長發育。柵欄組織中油細胞密度與葉片全氮含量呈顯著負相關，說明葉片中氮含量升高可能會降低油細胞密度。從相關性分析獲得啟示，也許可以在實際生產中通過某種經營措施來平衡油細胞大小和密度，比如通過合理的硼和氮等營養元素的精準施肥，促使葉片油細胞大小和密度達到較高含油率的生長狀態，可進行進一步的研究。