黑麥草對Cd-Zn復合脅迫的響應

白哲， 董馨嵐， 李銘紅

(1.浙江師范大學 行知學院，浙江 金華 321004； 2.浙江師范大學 生態研究所，浙江 金華 321000)

鎘(Cd)作為植物生長發育非必需元素，是目前重金屬污染中面積分布最廣、危害性最強的重金屬元素之一。環境中Cd濃度過高，會使植株矮小、生長遲緩，嚴重時甚至導致植株死亡[1]。且Cd極易被植物吸收累積進入食物鏈，對人類健康產生威脅[2]。Zn是植物生長發育的必需元素，具有調節光合作用、促進植物生長的重要功能，植物生理屏障對Zn具有一定抵抗力[3]，但Zn過量會導致植物代謝失衡，葉綠素合成受破壞，造成缺鐵性失綠及生長發育障礙。土壤中重金屬來源途徑多樣，且污染源并非單獨存在，通常是多種污染成分共存，產生綜合作用；Cd和Zn在元素周期表中均屬于ⅡB族元素，化學性質相似，因此，二者總是在自然界相伴而生，造成土壤重金屬復合污染[4]。

植物修復技術因其治理成本低廉、環境美學兼容、治理過程原位三大特性，成為重金屬土壤污染修復研究熱點[5]。植物可通過自身解毒機制，使重金屬在土壤中的濃度下降，從而使土壤被重新使用。黑麥草是一年生或多年生草本植物，生物量較大，易于種植，不僅對多種重金屬有較強的耐性和抗性，且對重金屬具有富集能力[6]。

徐衛紅等[7]研究發現，土壤中高濃度Zn、Cd共存時，黑麥草對Zn、Cd的吸收為協同效應，且植株吸收的重金屬Zn、Cd主要集中在地上部。目前，黑麥草受Cd、Zn污染的研究主要集中于單一元素，而關于Cd-Zn復合脅迫機理的研究仍較少。為了闡釋重金屬Cd-Zn復合脅迫對黑麥草的影響及黑麥草重金屬富集能力，本研究在Cd、Zn單一污染預實驗的基礎上，設置不同濃度梯度的Cd-Zn復合污染處理栽培試驗，檢測黑麥草幼苗生長、生理生化指標變化情況，并結合植物對重金屬的富集和轉移能力，探討黑麥草對Cd-Zn復合污染土壤的修復潛力，為尋找適宜修復Cd-Zn污染土壤的牧草提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑麥草種子購于金華市花卉苗木市場。土壤采自浙江師范大學農田試驗基地，取地表20 cm深度土壤，去除石塊、植物根系等雜質后置于陰涼通風處自然風干后備用。土壤pH值為6.8，有機質含量5.13 g·kg-1，全氮含量0.72 g·kg-1，速效磷含量18.6 mg·kg-1，速效鉀含量203.1 mg·kg-1，全Cd含量2.58 mg·kg-1，全Zn含量56.73 mg·kg-1。用分析純的CdCl2·2.5H2O和ZnSO4·7H2O配制成不同濃度梯度的重金屬溶液，與土壤充分混勻，靜置鈍化2周后作為供試土壤。

1.2 處理設計

根據相關文獻和我國土壤環境質量標準[8-9]，并且結合前期Cd、Zn單一污染對黑麥草種子萌發及幼苗影響的試驗結果，本研究中對重金屬Cd、Zn質量比的上限作適當延伸，分別選取土壤Cd濃度為10(A1)、50(A2)、100(A3)mg·kg-1；Zn濃度為100(B1)、400(B2)、800(B3)mg·kg-1；進行Cd和Zn二因子正交試驗設計，對照組CK(不加外源Cd和Zn)，每個處理3個重復。

黑麥草種子用70%乙醇滅菌3 min，去離子水沖洗后用濾紙吸干水分備用。試驗所用的花盆高15 cm，直徑20 cm，每盆裝土1 kg，播種50粒顆粒飽滿、大小均勻的種子。根據土壤水分狀況，每天或隔天澆等量去離子水，保證土壤持水量在70%左右，并將滲出溶液反復回收澆灌，使Cd、Zn濃度保持在設定水平。生長過程中，及時清除盆栽中其他雜草。試驗60 d后采集植株及根部土樣，進行生長發育指標、生理指標及吸收富集特征指標測定。

1.3 樣品處理與指標測定

完成植物生長周期后，取植物樣品先用自來水充分淋洗，再用0.1 mol·L-1稀鹽酸洗凈，最后用去離子水沖洗2～3次，并用濾紙吸干表面水分。將植株地上部與根部分開，105 ℃下殺青30 min，90 ℃下烘干至恒重稱量干重。同時取植物根部土壤，自然風干后，研磨至粉末狀后過100目篩待測。

選取植物樣品測定生理指標：葉綠素含量采用95%乙醇提取法[10]測定；葉綠素熒光參數采用便攜式脈沖調制葉綠素熒光儀(PAM-210)測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法[10]測定；細胞膜透性采用電導儀法測定。植物樣品采用HNO3-HClO4法消解；土壤樣品采用HCl-HNO3-HClO4法消解。采用電感耦合等離子體原子發射光譜儀(Inductively Coupledd Plasma-Atomic Emission Spectrometry，ICP-AES)測定植物與土壤中Cd、Zn的含量。

1.4 數據處理與分析

富集系數(bioconcentration factor，BCF)=植物體內重金屬含量/土壤中重金屬含量。

轉運系數(transfer coefficient，TF)=植物地上部重金屬含量/根系重金屬含量。

采用Excel 2010進行數據處理，采用SPSS 20.0進行方差分析及最小顯著差異性檢驗(LSD法)，采用Origin 8作圖。

2 結果與分析

2.1 Cd-Zn復合脅迫對黑麥草生長指標的影響

在同一Cd濃度時，黑麥草地上部長度及根系長度隨著重金屬Zn濃度增加而呈下降趨勢(表1)。在A3B3處理下，Cd-Zn復合污染對地上部長度及根系長度的抑制作用最明顯，較CK組分別降低74.67%和82.80%，差異顯著。

表1 Cd-Zn復合脅迫下黑麥草的生長指標

植物生物量能夠反映植物在脅迫環境中的耐受性和適應性[11]。由表1可知，黑麥草地上部生物量基本表現為A1>A2>A3。在A3B3處理下，黑麥草地上部生物量達到最小值，較CK組顯著降低92.63%。Cd-Zn污染條件下，黑麥草根系生物量均低于CK組，但差異未達到顯著水平，其中在A3B3處理時達到最小值，較CK組降低91.99%。

2.2 Cd-Zn復合脅迫對黑麥草生理指標的影響

葉綠素是光合作用的主要色素，其含量高低直接反映植株光合作用水平的強弱，可以作為植物抗逆性評價的一項重要指標[12-13]。高Cd濃度(A3)污染下，黑麥草葉綠素含量均低于CK組，且在A3B1時達到最小值，與CK組差異顯著，抑制效應最強，較CK組下降33.97%。葉綠素熒光參數包含PSⅡ反應中心光合量子轉換和光化學效率兩部分，它們可以通過葉綠素熒光參數波動來反應植物光合強度及生長狀態[14]。Cd-Zn復合污染條件下，黑麥草最大光化學效率(Fv/Fm)與潛在光化學效率(Fv/Fo)均受到抑制。在A1、A3處理的Cd濃度下，Fv/Fm與Fv/Fo隨著Zn濃度上升抑制作用逐漸增強，均在A3B3處理下達到最小值，較CK組分別顯著降低30.15%和57.31%(表2)。

表2 Cd-Zn復合脅迫下黑麥草的生理指標

脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質，脯氨酸含量是反映植物對外界環境重金屬脅迫響應的重要指標之一[15]。在中高Cd濃度(A2、A3)時，隨著土壤中Zn濃度增加，黑麥草脯氨酸含量均在B3處理時受到更強的促進作用，且在A3B3處理時葉片脯氨酸含量達到峰值，較CK組顯著增加231.16%(表2)。表明高濃度Zn能顯著促進黑麥草脯氨酸累積，以此減輕或避免重金屬對黑麥草的傷害。

細胞膜系統是植物細胞和外界環境進行物質交換和信息交流的界面和屏障，其穩定性是細胞進行正常生理功能的基礎[16]，重金屬脅迫可以破壞細胞膜的穩定性，導致細胞膜透性增加。在各復合污染處理中，除A1B1處理組外，黑麥草細胞膜透性均較CK組呈現不同程度的增強。在低Cd濃度(A1)時，黑麥草的細胞膜透性隨著Zn濃度上升而增大，A1B3較CK組增加86.76%；在中Cd濃度(A2)時，細胞膜透性較CK組顯著提高，在A2B3處理下增長最多，為133.76%。

2.3 Cd-Zn復合脅迫對黑麥草富集效果的影響

2.3.1 復合脅迫對Cd富集的影響

在植物對重金屬復合污染土壤修復潛力的研究中，重金屬累積含量能夠很大程度上反映植物的修復效果。隨著土壤Cd、Zn污染程度的加劇，黑麥草地上部及根系中Cd含量均呈逐步增加的趨勢(圖1)。通常植物對重金屬的吸收具有就近積累效應，即重金屬含量由高到低為為根>莖>葉，本試驗中黑麥草Cd含量也表現為根系>地上部。Cd-Zn復合污染下，黑麥草地上部和根系Cd含量在中高Cd濃度(A2、A3)處理時與CK組呈現顯著差異。在高Cd濃度(A3)時，黑麥草地上部及根系對Cd的累積隨Zn濃度增加而升高，且在A3B3達到峰值，較CK組分別增加96.06%、98.25%。可以發現，黑麥草地上部及根系Cd富集在Cd-Zn復合脅迫下表現出相近的變化規律，在高濃度Cd處理下土壤中Zn含量的增加，會促進黑麥草地上部及根系對Cd的吸收。

柱間無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2～3同。

2.3.2 復合脅迫對Zn富集含量的影響

Cd-Zn復合污染下，Zn在黑麥草地上部、根系富集情況表明，除A1B1根部外，黑麥草地上部及根系Zn含量均顯著高于CK組(圖2)。植物不同部位對Zn的吸收能力存在差異，黑麥草地上部對Zn的富集在中、高濃度(B2、B3)時得以表現，而黑麥草根系則在低濃度(B1)處理下就富集重金屬。這說明相較于地上部，黑麥草根系對重金屬的富集能力更強，且Cd、Zn間存在協同效應，增加重金屬Cd濃度會促進黑麥草吸收Zn。

黑麥草地上部在中、高Zn濃度(B2、B3)時，Zn富集含量隨著Cd濃度增加而升高，組內組間均表現出顯著差異；而根系對Zn的吸收在低Zn濃度(B1)下就表現出協同效應，說明黑麥草根系對Zn的吸收能力更強，且Cd含量增加會促進黑麥草吸收Zn。在A3B3處理時，黑麥草地上部及根系Zn富集含量均達到峰值，較CK組分別升高94.67%、92.32%。在植物體內，天然存在的Zn含量在1～160 mg·kg-1。由圖2可知，在重金屬Cd-Zn復合污染土壤條件下，黑麥草地上部、根系的Zn含量均超出天然存在范圍，說明黑麥草對Zn的吸收能力較強。

圖2 Cd-Zn復合脅迫下黑麥草地上部及根系Zn含量

2.3.3 復合脅迫對Cd、Zn富集系數的影響

富集系數可用來衡量植物對重金屬的吸收和富集能力，富集系數越大，表明植物吸收重金屬的能力越強，對修復土壤污染越有利。在Cd-Zn復合脅迫下，黑麥草Cd富集系數大于Zn，表明黑麥草對Cd的富集能力大于Zn，Cd更容易被黑麥草吸收(圖3)。低、中Cd濃度(A1、A2)時，黑麥草地上部及根系Cd富集系數隨Zn含量增加而降低，說明添加Zn會抑制黑麥草對Cd的吸收；高Cd濃度(A3)則有所增加。黑麥草地上部及根系對Cd的富集系數均在A2B1處理組達到峰值，分別為2.48、6.91。根系對Cd的富集系數除A1B3處理外，其余均大于1，可知黑麥草地下部具有強富集能力，屬于Cd根際富集植物。除A1B1處理組，黑麥草Zn富集系數表現為根系>地上部，說明黑麥草根系對Zn具有較強的富集能力。相同Zn濃度處理下，黑麥草地上部及根系Zn富集系數隨Cd濃度增加呈上升趨勢，且均在A3B3處理時達到最大，分別為2.21和2.64。

圖3 Cd-Zn復合脅迫下黑麥草對Cd、Zn的富集系數

2.3.4 復合脅迫對Cd、Zn轉運系數的影響

轉運系數反應植物將吸收的重金屬從根系轉移到地上部的能力。黑麥草在Cd-Zn復合污染下對Cd轉運系數均低于1，在A1B2處理時對Cd轉運系數最高，達0.94，說明Cd在黑麥草地上部分轉運能力低，根系固定能力強(圖4)。而黑麥草在低濃度(A1B1)污染條件下，對Zn轉運系數大于1，為1.64，說明黑麥草在該污染條件下能較容易地從根系向地上部轉移重金屬Zn。

處理組合間無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

當重金屬污染程度超過植株耐受范圍，會對植株的生理代謝和營養吸收等產生毒害，通常表現為抑制植物幼苗生長，促進植物壞死[17]。本試驗表明，Cd-Zn復合脅迫下，黑麥草地上部及根系生長受到顯著抑制；且黑麥草生物量隨Cd和Zn濃度升高而下降，均在A3B3處理下達到最小值，這與侯琪琪[8]的研究結果一致，可能是土壤中Cd、Zn濃度超過了黑麥草的耐受限度，從而影響黑麥草幼苗的生長、細胞分裂及多種代謝活動。

逆境條件會對植物生理代謝產生影響，試驗表明Cd-Zn復合污染下，黑麥草體內葉綠素含量、葉綠素熒光參數、脯氨酸含量及細胞膜透性均受到不同程度影響。本試驗顯示，高濃度Cd-Zn復合污染下黑麥草葉綠素含量顯著低于CK組，可能是由于重金屬毒害使葉綠體結構和功能遭受破壞，抑制了葉綠體片層中捕光復合體合成，同時使葉綠體相關酶活性受到抑制，阻礙了葉綠素的合成[15,18]。葉綠素熒光是檢測逆境對植物PSⅡ反應中心損傷程度的靈敏探針，可以反映重金屬對光合作用整體機構的脅迫程度[19]。本試驗中，黑麥草受重金屬Cd-Zn脅迫，Fv/Fm與Fv/Fo均低于CK組，說明重金屬Cd、Zn對黑麥草光合作用整體機制產生抑制作用，這與Rau等[20]的結論相似。重金屬脅迫會打破植物細胞中活性氧與自由基的平衡，導致細胞膜結構受到破壞，此時植物細胞通過分泌大量脯氨酸等逆境保護物質來緩解重金屬傷害。本研究發現，在重金屬Cd-Zn復合脅迫下，黑麥草中脯氨酸含量隨著重金屬濃度升高而增加，在A3B3處理時達到峰值，較CK組顯著增加69.80%。Cd-Zn脅迫下黑麥草細胞膜透性較CK組表現出不同程度的增大，這與王友保等[21]在Cu污染環境中對高羊茅細胞膜透性的分析類似，均是由于重金屬對植物的毒害作用造成電導率升高與細胞膜系統破壞所致。

相關研究[22]表明，Cd、Zn之間的交互作用因土壤理化性質、植物種類、組織部位及重金屬濃度而異。潘秀等[23]研究發現，Cd-Zn交互作用影響互花米草中重金屬的積累，無論地上部或根部，添加Zn都促進植物吸收重金屬Cd。也有試驗[7]證明，Cd、Zn的協同效應與環境中重金屬的濃度相關，當環境中Cd、Zn濃度差異較大時，黑麥草對Cd、Zn的吸收表現為相互抑制；而當環境中Cd、Zn濃度均高時，黑麥草對Cd、Zn的吸收表現為協同效應。本試驗也得到相似結論，黑麥草對Cd、Zn的富集均在高濃度處理下出現協同作用，即在鎘(鋅)濃度保持不變時增加鋅(鎘)能促進植物對鎘(鋅)的富集；且均在高濃度(A3B3)Cd-Zn聯合處理下，黑麥草地上部及根系對重金屬Cd、Zn吸收達到峰值。以上結果表明，重金屬元素之間的交互作用復雜多樣，關于黑麥草對Cd、Zn交互作用的具體機理還需進一步闡明。

富集系數、轉運系數是評價不同植物對土壤重金屬富集、轉運能力的重要指標，可以判斷植物對土壤的修復效果。本研究中黑麥草對Cd、Zn富集系數結果顯示，在Cd-Zn復合污染的土壤中，黑麥草對重金屬Cd富集系數大于Zn，隨復合重金屬污染濃度升高，Cd、Zn富集系數都呈現出上升趨勢，這與姜礅等[24]在研究銀中楊對Cd、Zn、Pb富集特性的結論相似。張堯等[25]研究指出，黑麥草能夠有效富集土壤中的Cd，且富集的Cd主要積累在根部。本試驗也得出類似結論，黑麥草在Cd-Zn復合脅迫下，根部富集系數大于地上部富集系數，可能是由于在植物對重金屬的耐受機制中，根系通常能釋放單糖、氨基酸等多種對有毒重金屬起固定作用的有機化合物[26]。轉運系數反映植物將吸收的重金屬從根系轉移到地上部的能力，轉運系數越大，重金屬由根系向地上部的轉運能力越強。Clemens[27]認為，根系吸收的Cd主要通過木質部運輸到地上部，其運輸效率取決于根系細胞壁和液泡對Cd吸收、固定以及根部細胞間共質體通道的運輸效率，根系對重金屬轉移能力的高低還與木質部的裝載能力有關。本研究表明，黑麥草對于Cd-Zn復合污染土壤具有良好的修復效果，在中、高濃度下，隨著重金屬濃度增加，黑麥草對重金屬的轉運系數增大。這可能是由于重金屬脅迫濃度增加，黑麥草細胞壁和液泡對重金屬吸收、固定能力降低，使更多重金屬進入木質部中，導致運往地上部的Cd、Zn含量增加，最終引起轉運系數呈增加的趨勢。

綜合考慮植物生長、生理及富集各項指標，Cd-Zn復合脅迫對黑麥草幼苗生長的抑制作用隨重金屬濃度升高而增強，葉綠素含量和最大光化學效率則在高濃度復合污染土壤中表現出顯著差異。此外，在高濃度Cd-Zn復合脅迫下，黑麥草可以通過調整自身的某些機能來抵抗重金屬脅迫的損害，使植株生長不受強烈Cd、Zn脅迫的影響，表現出較強耐性。Cd-Zn復合脅迫條件下，黑麥草吸收重金屬Cd、Zn能力均為根系>地上部，且當環境中重金屬濃度較高時，黑麥草對Cd、Zn的吸收呈協同效應。黑麥草還具有生長迅速、分蘗力強、年收多茬、生物量大等優勢，因此，可以作為修復重金屬污染土壤的新材料，尤其可能對Cd-Zn復合污染土壤的修復效果更好。