不同基因型鵝星狀病毒鑒別診斷RT-PCR方法的建立

王宏宇， 朱寅初， 云濤， 華炯鋼， 葉偉成， 倪征， 陳柳， 張存

(1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021； 2.南京農業大學 動物醫學院，江蘇 南京 210095)

2014年在我國湖南首次報道發現鵝星狀病毒(Goose astrovirus，GAstV)，隨后在遼寧、山東、江蘇、安徽乃至廣東等主要養鵝省份均陸續出現以內臟痛風為典型臨床癥狀的傳染病，經分離鑒定，病原為星狀病毒，且基因組序列有別于湖南發現毒株[1-3]。當前證據顯示，該病主要可導致5～20 d齡雛鵝發病，患病雛鵝表現為精神沉郁，臥地不動，采食下降甚至死亡，剖檢可見心臟和肝臟表面明顯的粉末狀白色尿酸鹽沉積，腎臟腫大壞死[4]。流行病學調查顯示，近年來該病造成的死亡率由最初的5%逐漸上升，最高可達50%，給我國養鵝業帶來嚴重危害，造成巨大經濟損失[5]。

鵝星狀病毒基因組分析顯示，其為單股正鏈無囊膜RNA病毒，基因組全長約7～8 kb，兩側為5′UTR和3′UTR(具PolyA尾)，包含ORF1a、ORF1b和ORF2 3個開放閱讀框(ORF)[6-8]。ORF1a編碼多種非機構蛋白；ORF1b序列與ORF1a存在重疊，編碼保守的RNA依賴性RNA聚合酶(RbRp)；ORF2為病毒結構蛋白，包裹病毒外表面，形成衣殼和纖突結構。隨著越來越多病毒基因組的測序顯示，已報道的鵝星狀病毒存在兩種基因型，核酸序列差異大，臨床調查顯示單一和混合病毒感染等多種情況均有出現；鑒于當前鵝星狀病毒的致病機制尚不清楚，感染情況復雜，因而對該病毒的及時檢測發現對后期防控尤為重要。在實際病原鑒定中針對一種基因型的鵝星狀病毒的PCR檢測不僅目標樣本單一，而且操作工序復雜，成本高，費時費力，因而本試驗根據GenBank公布的GAstV 編碼RbRp的基因序列設計特異性引物，嘗試建立雙重一步法RT-PCR檢測體系，可直接以RNA為模板，并達到同一體系檢測不同基因型鵝星狀病毒的目的，為臨床混合感染和流行病學調查提供快速有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2017—2020年，共采集來自浙江和江蘇共73份雛鵝及鵝胚樣本，全部樣品記錄品種、日齡、組織、地點等信息，并于-80 ℃冰箱保存。鴨瘟[9](Duck plague virus，DPV)、鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)、坦布蘇病毒[10](Goose-origin tembusu virus，GTMUV)、鵝呼腸孤病毒[11](Goose-origin reovirus muscovy duck reovirus，GRV)、H9N2亞型禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)均由本實驗室保存。磁珠法病毒RNA抽提試劑盒購自濟帆科技生物有限公司。TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0和DNA Marker 5000為TaKaRa公司產品；HiScript II One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)為Vazyme公司產品；Plasmid Mini Kit為OMEGA公司產品。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank上發布的兩種不同序列的GAstV病毒基因序列，選取RdRp保守序列區域利用Oligo 7.0軟件分別設計兩對特異性引物，用于擴增對應GAstV病毒，引物由鉑尚生物技術公司合成(表1)。

表1 試驗引物的基本情況

1.3 PCR擴增

單一RT-PCR分別以對應的鵝星狀病毒作模板擴增，建立20 μL體系：2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，RNA模板1 μL。反應條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，35個循環，72 ℃ 7 min，4 ℃保存擴增產物；經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，測序鑒定。

對雙重RT-PCR反應的引物、模板等用量，退火溫度等參數設置梯度，通過優化和多次重復實驗后，確定最佳反應體系，同時設置陰性對照。PCR擴增產物進行凝膠電泳分析鑒定。

1.4 雙重RT-PCR特異性試驗

根據建立并優化的多重PCR方法對水禽常見病毒包括GTMUV、GPV、MDRV、DPV和AIV進行檢測，以鑒定其特異性。

1.5 敏感性試驗

使用目的片段所在基因的克隆載體作為陽性質粒，用NanoDrop測定核酸濃度，計算陽性質粒拷貝數。其后將質粒模板進行10倍梯度稀釋，并以優化條件進行多重PCR敏感性測試。

1.6 穩定性試驗

用建立的雙重RT-PCR方法間隔一周對樣本重復檢測，每次不同濃度設置3個重復，連續檢測3次后，以驗證此PCR方法的可靠性和穩定性。

1.7 臨床樣本應用試驗

將實驗室在周圍地區養殖場采集和送檢的病死鵝及鵝胚等樣本73份進行核酸提取，應用建立的雙重RT-PCR方法對其進行檢測，并用單一的PCR方法進行復檢比較，以檢驗此方法在實際應用中的效果。

2 結果與分析

2.1 單片段擴增

根據已經公布的新型鵝星狀病毒全基因組序列，進化分析顯示其可分為兩個基因型，Group Ⅰ和GroupⅡ，且兩者序列差異較大(圖1)。單一引物PCR結果顯示，各引物可有效擴增出目的基因，條帶單一清晰，條帶大小與預期相符，彼此間序列不產生交叉，測序結果比對證實為鵝星狀病毒編碼RdRp基因序列，大小分別為Ⅰ型441 bp，Ⅱ型為277 bp(圖2)，適合鵝星狀病毒的檢測及分型鑒定。

圖1 鵝星狀病毒RbRp核酸序列進化樹

M—DL1000；Ⅰ—基因Ⅰ型；Ⅱ—基因Ⅱ型；N—陰性對照；A—Ⅰ型核酸樣本；B—Ⅱ型核酸樣本。

2.2 雙重RT-PCR檢測方法的優化

通過設置不同退火溫度及引物混合濃度等參數的比較試驗，根據擴增產物在2%瓊脂糖凝膠成像結果條帶明暗度、清晰度，分析得出退火溫度在50～54 ℃皆可，適宜引物濃度GastV Ⅰ和Ⅱ各為1 μmol·L-1(圖3～4)。最終擴增程序為50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，35個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

M—DL1000；1—0.25 μmol·L-1；2—0.5 μmol·L-1；3—1 μmol·L-1；4—2 μmol·L-1；N—陰性對照。

M—DL1000；1—50 ℃；2—52 ℃；3—54 ℃；4—56 ℃；5—58 ℃；6—60 ℃；N—陰性對照。

2.3 PCR方法特異性

采用優化后的雙重RT-PCR反應條件，對不同鵝星狀病毒、鵝細小病毒、禽流感病毒、坦布蘇病毒、鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒進行檢測，結果顯示，該引物只能擴增出星狀病毒相應的目的條帶，條帶清晰，其他對鵝常見病毒種類和陰性對照未見擴增產物(圖5)。上述結果表明，該雙重RT-PCR方法有良好的特異性。

M—DL1000；1—GastV；2—TMUV；3—GPV；4—MDRV；5—DPV；6—AIV；N—陰性對照。

2.4 敏感性

對10倍稀釋的陽性核酸樣本進行PCR檢測，再根據前期公式計算的拷貝數換算，最終結果顯示，所建立的雙重RT-PCR方法對GAstV Ⅰ型和Ⅱ型的的最低檢測模板量分別為103和102拷貝(圖6)。

M—DL1000；A—Ⅰ型單一PCR敏感性；B—Ⅱ型單一PCR敏感性；C—雙重PCR敏感性；1～9—109～101拷貝·mL-1。

2.5 重復性檢測

應用此雙重RT-PCR檢測方法，間隔一周對同一模板進行反復檢測，共重復3次，每次3個重復，并設置陰性對照。結果顯示，多次試驗結果一致，表明所建立的PCR方法具有較高的穩定性和可重復性。

2.6 臨床樣本的檢測應用

利用上述建立的雙重RT-PCR方法對江浙數個養殖場采集到的病樣進行檢測，結果表明，73份病樣中有68份為鵝星狀病毒陽性，陽性率93.2%(圖7)；其中GAstV Ⅰ型和Ⅱ型均陽性的有5份，而GAstV Ⅱ型單獨存在的有63份，GastV Ⅰ單獨存在的陽性樣本則只有一個。該結果與單一PCR檢測結果完全相同。

M—DL1000；1～14—臨床樣品；N—陰性對照。

3 討論

鵝星狀病毒作為新發疫病病原，近年已給各地養鵝業帶來巨大經濟損失。當前在我國多地區雛鵝群中出現流行，臨床暴發痛風；在排除飼料和環境等問題后，明確了雛鵝痛風的主要病因是由鵝星狀病毒感染引起[12]。病毒基因組序列同源性分析顯示，臨床鵝星狀病毒主要存在兩種不同基因型分離株，且兩種病毒核酸序列差異較大，但都屬于星狀病毒成員，感染宿主主要為20 d齡雛鵝；分別為以FLX株為代表的Group Ⅰ型和以GD株為代表的Group Ⅱ型，而這兩種毒株也呈現混合感染現象，至今尚不清楚兩種基因型病毒的各自致病機理。傳統的病毒分離、電鏡觀察鑒定、血清學試驗等病毒檢測方法費時費力，操作難度高，特異性差；準確快速的診斷技術在病原體鑒別診斷上應用價值較大，尤其是對于混合感染。雖然已有研究人員建立了GAstV的PCR檢測方法[13]，但都是針對單一基因型病毒的檢測，存在操作煩瑣、不能同時檢測到兩種基因型病毒的不足。而鵝星狀病毒作為新發病原，對其研究甚少，不同毒株及其致病機制尚不清楚，因此，建立快速檢測該病毒感染并且可區分基因型的方法，將有利于防控該病。

兩種基因型鵝星狀病毒基因組均由3個開放閱讀框組成，ORF1a、ORF1b和ORF2，分別主要編碼絲氨酸蛋白酶、RNA依賴性RNA聚合酶和衣殼蛋白。本研究選取其RNA依賴性聚合酶區域基因序列作為檢測靶基因，設計特異性引物，建立的一步法RT-PCR方法，操作簡單，可實現以RNA為檢測模板，在反應體系中完成RNA反轉錄并擴增。經對反應體系和條件的摸索優化后，敏感性高，最低可檢測出103拷貝的星狀病毒；特異性好，條帶單一，不會因其他RNA病毒而受到干擾，產物可回收測序。應用所建立的一步法RT-PCR檢測方法對臨床收集到的73份樣本進行測試，發現本次樣品中仍以Ⅱ型病毒更為普遍，是優勢毒株；Ⅱ型病毒與Ⅰ型共同感染的情況也存在，發現5例，占檢測總數6.8%；僅發現一例Ⅰ型病毒單一感染情況，這與已有研究報道的情況相符合[14-17]。結合其他學者的流行病學調查顯示，不同地區病毒感染情況存在差異，部分地區主要以混合感染為主，其樣品中混合感染可達94.03%[18]，值得引起重視。此外，報道顯示兩種基因型GAstV分離株都有致病能力，可致鵝胚死亡，并有明顯病變，因而對GAstV應加以重視。本研究建立的方法快速、靈敏、特異且穩定，操作簡單，設備要求低，將為GAstV臨床診斷和早期流行病毒調查提供快捷可靠的技術手段。