芋種質葉綠體基因trnH-psbA序列特征及遺傳多樣性分析

洪霞， 陳孝賞， 王嬌陽， 屈為棟， 邱莉萍， 陳銀龍

(臺州市農業科學研究院，浙江 臺州 317000)

芋多年生，屬天南星科芋屬植物，在世界上廣為栽培，中國是重要的起源地之一，以珠江流域、臺灣地區種植最多，其次是長江及淮河流域[1]。芋的地下部球莖、葉片、葉柄、花等部位可作蔬菜，芋具有豐富的營養價值，淀粉、可溶性糖、蛋白質含量較高，含有多種維生素與礦物質[2]，此外，芋多糖在降血糖、抗腫瘤、提高機體免疫力等方面有較高的藥用價值[3-4]。浙江省歷來有種植芋用以食用與藥用的傳統，各地芋小種眾多，且具有較好的經濟效益[5-6]。

在基因與環境的共同作用下，物種形成了豐富的遺傳多樣性，成為寶貴的育種種質資源。這種遺傳多樣性還受到生活史特性、繁育方式、人工選擇馴化、地理分布等多種因素的影響[7]。種質資源的保護工作日益受到重視，與實現種業現代化息息相關。全國種質資源普查行動已作為重點工作之一，而種質的遺傳多樣性研究已成為研究熱點。隨著基因工程的發展與測序技術的進步，rbcL、matK、trnH-psbA等DNA序列分析為種質的分類、鑒定提供了有效的方法，在茶樹、辣椒、水稻等作物獲得較好應用[8-10]。有研究利用rbcL+trnH-psbA結合序列以及ITS序列對芋屬內各種之間進行區分與鑒定[11-12]，其中，trnH-psbA序列是葉綠體基因間隔非編碼區，進化速率快，變異位點信息豐富。浙江省芋種質資源豐富，特別是地方小種多，本研究在前期性狀調查的基礎上，對不同地源的芋地方種進行trnH-psbA序列結構與進化分析，為芋種質的DNA條形碼應用、遺傳多樣性分析以及進一步保護利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的30份芋材料在浙江省各縣市收集而來，屬當地種植小種。2019—2020年種植于浙江省芋種質資源圃，2020年7月選取幼嫩葉片，低溫保存。具體材料信息見表1。

表1 供試的30份浙江芋種質資源

1.2 DNA提取與PCR擴增

取低溫保存的芋葉片，加入液氮并用研缽磨成細粉，使用CTAB法提取全基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠鑒定DNA純度，在測定核酸濃度后用滅過菌的去離子水稀釋約至50 ng·μL-1，-20 ℃保存備用。trnH-psbA片段擴增正向引物5′-GTTAT GCATGAACGTAATGCTC-3′，反向引物5′-CGCGCA TGGTG-GATTCACAATCC-3′，使用KODFX高保真酶擴增，總反應體系50 μL，其中2×KODFX buffer 25 μL、2 mmoL·L-1dNTPs 10 μL、0.5 μmoL·L-1的正反引物各1.5 μL、DNA模板2.5 μL、KODFX聚合酶1 μL。序列擴增在BIORED PCR擴增儀上進行。擴增程序為94 ℃預變性2 min，98 ℃變性20 s，57.5 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min；35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠檢測擴增條帶，條帶清晰單一的樣品由金唯智(江蘇)生物技術公司測序。

1.3 數據統計與分析

對獲得的結果使用Condon code aligner v.8.0.2進行拼接，去除低質量序列，保留引物序列。使用MEGA X[13]進行序列比對，統計序列的特征，如序列的GC含量、變異位點、保守位點和信息位點，計算不同地方小種的遺傳距離，使用最大似然法構建進化樹。群體的單倍型數、單倍型多樣性、單倍型多樣性標準差、單倍型多樣性方差、中性檢驗分析數值(Tajima′D，Fu and Lis F值)由DnaSP v.5.10[14]軟件統計。

2 結果與分析

2.1 不同地源種質葉綠體基因trnH-psbA序列差異分析

通過對30份不同地源的芋種質trnH-psbA序列克隆分析，結果表明，trnH-psbA序列長度為730～739 bp，GC含量為22.4%～22.9%，存在3種不同的類型，其中屬于類型Ⅰ序列的資源最多，有21份，類型Ⅱ最少只有4份，類型Ⅲ有5份。30份資源的保守位點為717個，變異位點為13個，全部為自裔位點；插入/缺失位點位于339 bp、533～598 bp、617～624 bp；二倍簡并位點187個，四倍簡并位點為53個(表2)。

表2 不同芋種質trnH-psbA序列變異位點

2.2 單倍型多樣性與中性檢驗分析

單倍型多樣性分析表明30份芋資源trnH-psbA序列分離位點為13個，單倍型數為2個，單倍型多樣性為0.457 06，核苷酸多樣性為0.005 15，單倍型多樣性方差為0.008 41，標準差為0.092。利用Tajima′D檢驗得D值為0.888 91，P>0.1；Fu and Lis F檢驗值為1.374 12，P>0.1。上述結果表明物種水平上芋資源trnH-psbA序列符合中性進化假設模型。

2.3 芋種質資源的遺傳距離與聚類分析

30份芋種質資源的遺傳距離變化范圍較小，為0～0.018 1，平均遺傳距離為0.005 2，其中類型Ⅲ的芋資源全部來自溫州，與其他2種類型的遺傳距離最大，彼此之間的遺傳距離為0，而類型Ⅰ與類型Ⅱ之間的遺傳距離也為0。由最大似然法的聚類分析也可以看到，在100%的自展支持率下，30份芋種質資源分為2個分支，第一個分支有25份資源，由類型Ⅰ與類型Ⅱ組成，在浙江省各縣市均有分布，第二個分支僅有5份資源，全部來自溫州(圖1)。

圖1 30份芋資源的聚類

3 小結與討論

植物的遺傳進化與基因、環境、地理隔離等相關[15-16]。應用DNA條形碼基因分析芋屬的分子進化以及遺傳多樣性已有相關研究，表明利用序列差異能夠區分不同的芋族，但是利用不同芋小種深入分析同種芋的序列差異性與進化的報道較少。本分析浙江省不同區域收集的芋資源，發現30份種質資源序列長度為730～739 bp，差異序列有3種，單倍型有2種，保守位點有717個，多態性位點13個，遺傳距離0～0.018 1，不同類型的遺傳距離較小，這可能跟芋的栽培引種相關；溫州區域的5份資源與其他資源遺傳距離較大，聚類自成一支，表明浙江省內的芋存在一定的地理隔離，導致分化，trnH-psbA序列的差異可以明確溫州區域芋種質的進化地位。

30份資源的單倍型多樣性為0.457 06，Tajima′D檢驗的D值、Fu and Lis F檢驗值均大于零，但無顯著差異，表明物種水平上序列的進化符合中性進化假設，這可能跟芋自身的特點相關。芋雖然在浙江省內各地區均有分布，但自然開花少，異交率低，基本為地方小種；此外，據調查芋種植的農家自留種較多[17-18]。

通過對芋資源的聚類分析發現，5份來自溫州的芋資源變異序列類型Ⅲ由2份紫紅柄魁芋與3份烏綠柄多子芋組成；根據序列的差異類型，類型Ⅱ與類型Ⅰ聚在一支，但類型Ⅱ的4份資源全為綠柄多子芋，這表明序列的差異與芋的表型具有一定關聯。綜上所述，基于序列的差異分析地方芋種的遺傳多樣性，表明雖然芋有長期的引種馴化與栽培歷史，但不同的地方性小種仍存在一定的地理隔離，具有其自身生物學特點。這也證明了對地方芋種質資源加強保護的必要性，它們是芋品種改良重要的種質資源基礎。上述研究將為芋地方種的進一步保護、利用、分子標記開發等提供理論依據。