培養時間對中華羊茅菌絲生長及化感作用的影響

周連玉， 焦璐， 羅巧玉， 蔣霞

(青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室 青海省青藏高原生物多樣性形成機制與綜合利用重點實驗室青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810016)

許多研究關注禾草類植物與內生真菌互作的關系，禾草類植物內生真菌屬于香燭菌屬Epichloespp.或其無性系Neotyphodium屬[1]，體外培養時菌絲生長緩慢[2]。內生真菌在植物體內系活體營養，仿佛是構成植物的一個組織，在體內生長并發揮多重作用[3]。近30 a來，尤其在黑麥草屬和羊茅屬等禾草類的研究表明，內生真菌促進其地上部分、根系的生長[4-5]，提高宿主適應非生物和生物脅迫的能力[6]。

化感作用是指植物或微生物通過向環境中釋放某些化學物質從而對其他植物或微生物產生作用。一些研究[7-10]報道了內生真菌活體營養或者腐生營養培養時，表現出不同程度的化感作用。中華羊茅(Festucasinensis)是一種內生真菌侵染率高的多年生草本植物，具有適口性好、營養價值高、抗寒、抗旱、發病率低等優勢[11-13]。本研究以中華羊茅Epichloesp.菌株為材料，探討在培養過程中菌絲體生物量的變化規律以及發酵液的化感作用，旨在為中華羊茅內生真菌進一步的開發利用提供一定的理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

中華羊茅內生真菌Epichloesp.菌株保存于青海師范大學微生物實驗室。

中華羊茅種子由蘭州大學草地保護所提供。

PDA培養基用于菌株分離純化，配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。PDB培養基作為液體菌種制備的培養基，配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。發酵培養基配方為山梨醇100.0 g、酵母膏3.0 g、葡萄糖40.0 g、色氨酸0.8 g、谷氨酸10.0 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 5.6[14]。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的培養

將3塊直徑為4 mm的菌塊接種于PDB培養基中，150 mL三角瓶中裝入100 mL培養液，于25 ℃、130 r·min-1搖床培養15 d，所獲培養液作為液體菌種。將液體菌種3 mL接種至發酵培養基中，150 mL三角瓶中裝入100 mL培養液，25 ℃、130 r·min-1培養，在培養10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d時分別測定菌絲體生物量。

1.2.2 菌絲體生物量的測定

發酵產物經兩層紗布過濾收集發酵液和菌絲體，發酵液用于生物活性測定，菌絲體經蒸餾水沖洗數次后，于60 ℃干燥至恒重，電子天平稱重測得菌絲體生物量。

1.2.3Epichloesp.發酵液對中華羊茅幼苗生長的影響

挑選籽粒飽滿的中華羊茅種子，首先用75%的乙醇表面滅菌1 min，然后用無菌水沖洗3次，將種子分別在不同培養時間的發酵液原液(X)、10倍稀釋液(10X)、20倍稀釋液(20X)中浸泡24 h，以無菌水處理為對照，將種子放到鋪有兩層滅菌濾紙的培養皿中，每皿50粒，每日補充無菌水，以潤濕濾紙為準，設3個重復，14 d后測定各處理樣品根長和苗長。

依據Williamson等[15]介紹的方法來衡量發酵液的化感作用強度，計算公式RI=1-C/T，RI表示敏感指數，C表示對照值，T表示處理值。

1.3 統計分析

試驗數據結果均采用平均值±標準誤表示，菌絲體生物量指標釆用SPSS 16.0統計分析軟件進行單因素方差分析(LSD，P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 深層液態發酵過程中菌絲體生長規律

深層液態培養過程中Epichloesp.菌絲體生長變化曲線見圖1。菌絲體干重與培養時間的關系呈現雙對數曲線關系，回歸方程式為lgY=-0.816 8lgX2+2.622 4lgX-0.455 3，其中Y為菌絲體干重，X為培養時間，R2=0.963 3。培養40～45 d菌絲體生長量達到最高值，顯著高于其他培養時間(P<0.05)，培養45 d后菌體出現自溶現象。

不同培養時間的數據之間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 Epichloe sp.對中華羊茅幼苗生長的影響

從表1可見，各處理與對照相比，除處理25 d和40 d的發酵液20倍稀釋液對苗長有抑制作用外，其他各處理均促進苗的伸長，其中促進效果較好的處理依次為：培養20 d的發酵液稀釋20倍>培養60 d的發酵液稀釋10倍>培養50 d的發酵液稀釋10倍。發酵液對根長的影響與苗長不一樣，27.27%的處理抑制根的伸長，69.70%的處理促進根的伸長。促進根伸長效果好的處理為培養20 d和30 d的發酵原液，抑制作用最強的處理為培養45 d的發酵液稀釋20倍，抑制效率為68.00%。對苗長和根長均有促進作用的處理占總處理的66.67%；只有培養40 d的發酵液稀釋20倍時，對幼苗和根的伸長均具有抑制作用，抑制效率分別為28.76%和19.15%。

表1 Epichloe sp.發酵液對中華羊茅幼苗生長的影響

3 小結與討論

多數從固體培養方式對黑麥草、高羊茅、醉馬草、中華羊茅禾草內生真菌菌株生理特性進行相關研究[16-18]。本試驗中華羊茅內生真菌在液體培養基質中生長比較緩慢，于培養40～45 d菌絲體生長量達到最高值，菌絲體生物量與培養時間之間呈雙對數曲線關系，與以往研究[19]的結果相似。

化感作用與真菌發酵液的濃度密切相關。孫鋒[20]以不同濃度木霉發酵液處理抗蟲棉種子，發現50倍稀釋液顯著增加幼苗根系長度和質量。不同濃度蜜環菌發酵液對油菜種子萌發后苗和根的作用表現是不同的，當發酵液濃度為10%時促進苗伸長的作用最明顯；對幼苗根的抑制作用，呈現出隨發酵液濃度增加而抑制效果增強的趨勢[21]。彩色馬勃菌絲體的乙醇提取液對油菜種子的發芽及幼苗的生長有明顯的抑制作用[22]。本研究發現，相同培養時間不同稀釋倍數發酵液，其化感效果也不一致，隨著培養20 d的發酵液稀釋倍數增加，對苗長促進作用逐漸增強；而培養時間50 d和60 d的發酵液，隨稀釋倍數增加對苗長促進作用表現為先升后降；培養時間35 d的發酵液對根長的抑制作用表現為隨著稀釋倍數增加化感效果不斷增加；這些研究結果與上述報道的結果相似。

一些研究[4,23-25]發現，內生真菌可能產生較多的吲哚乙酸或赤霉素，以此來增加植株的根重和總生物量。Prestidge等[26]指出，多年生黑麥草的水浸提液明顯抑制白三葉苗根的生長，此外，也對白三葉的干重具有顯著抑制效果[8]。Springer[27]研究表明，與E-高羊茅相比，E+高羊茅對三葉草生長的抑制作用更強，說明內生真菌能增強植物的化感效應。楊松等[7]試驗表明，內生真菌對不同植物發揮的化感效果不一致，E+披堿草顯著促進了多年生黑麥草的苗長，而對苗重有顯著抑制作用；E+披堿草草粉顯著抑制了高羊茅的根長、苗長和苗重，而顯著促進了其根重。王偉等[10]研究發現，多數核桃內生真菌菌株產生的代謝產物對小麥幼芽和幼根有不同程度的抑制作用。

曾任森等[28]對日本曲霉發酵液化感作用的研究發現，營養條件、pH影響發酵液對幼苗生長的抑制效果。趙昕梅等[9]從野生鐵皮石斛分離到4株內生真菌菌株，鐮刀菌屬菌株TPSH3發酵液對宿主生長具有一定的抑制作用，菌株TPSH4發酵液表現出顯著的促進作用，且不同發酵時間的發酵液對宿主促生作用有一定的差別。本試驗中不同發酵時間的發酵液對幼苗苗長和根長的化感作用不相同，發酵時間為20 d的20倍稀釋液或原液分別對苗長和根長具有更強的促進作用；在抑制作用方面，對苗長和根長的抑制效果最大的分別為培養40 d和45 d的20倍稀釋液，這與前人研究的結果一致，說明中華羊茅Epichloesp.代謝產物中存在化感物質，至于化感物質的具體化學成分有待研究。