理脾復方制劑及硫酸鋅對大鼠結腸平滑肌細胞增殖及其腦腸肽的影響

劉啟艷， 詹偉， 高娜， 張力文， 龐平， 李春， 彭玉

小兒厭食癥指排除全身性和消化道器質性疾病，較長時間的食欲減退或消失、食量減少甚至拒食的一種常見疾病[1]。我國學齡前兒童厭食癥發病率為12%～34%，每年有遞增趨勢[2]。若本病治療不及時，可影響兒童生長發育，輕者發生疳證(營養不良)，重者并發佝僂病以及貧血等[3]。因此，小兒厭食癥仍是中西醫兒科醫生共同關注及防治的疾病之一。目前研究表明，小兒厭食癥的發生多種腦腸肽異常變化有關，如神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)、八肽膽囊收縮素(cholecystokinin-octopeptide，CCK-8)、瘦素(leptin，LP)[4-6]等。因此，認為腦腸肽異常表達可導致“腦腸肽-食欲中樞紊亂”，這是發生小兒厭食的重要環節[7]。在治療小兒厭食癥諸多藥物中，微量元素鋅是最為常見藥物，而中藥也具有較強的優勢。理脾復方制劑是貴州中醫藥大學第二附屬醫院治療小兒厭食的驗方-運脾散(院內制劑名為運脾顆粒)基礎上研發的實驗用顆粒制劑。前期研究發現，運脾散治療厭食的有效率達93.3%[8]。目前，中西醫藥物發揮其治療研究機制多從血液或組織標本進行探索，而從細胞水平進行研究甚少。故此，本研究通過低、中、高劑量理脾復方制劑和硫酸鋅含藥血清作用于大鼠結腸平滑肌細胞(colon smooth muscle cells，CSMCs)，開展理脾復方制劑和硫酸鋅含藥血清對大鼠CSMCs增殖及其該細胞分泌的LP、NPY、CCK-8的調控影響，以期研究成果能闡釋理脾復方制劑和硫酸鋅治療厭食的作用機制與靶點。

1 材料與方法

1.1 動物 30日齡SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量(60±5)g，生產許可合格證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 實驗藥物 理脾復方制劑組方藥材(蒼術、白術、茯苓、薏苡仁各10 g，山藥、陳皮、枳殼、神曲、甘草各6 g)由貴州中醫藥大學第二附屬醫院中藥房提供，經貴州中醫藥大學中藥鑒定教研室劉曉龍博士鑒定，委托貴州中醫藥大學藥學院劉文教授參照陳大業方法[9-10]制備理脾復方制劑顆粒，其含量為2.70 g/kg，供試品樣品按干燥品計算，含柚皮苷(C27H32O11)應不得<0.98 mg/g，含橙皮苷(C28H34O13)不得<0.52 mg/g；硫酸鋅口服液(浙江迪耳藥業有限公司，批號：13171001)。

1.3 主要試劑 高糖培養基(Gibco)；0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液(HyClone)；胎牛血清(Sera)；綿羊血清、二甲基亞砜(Solarbio)；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒兔抗鼠、DAB顯色試劑盒(邁新試劑)；抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白抗體(博士德生物)；細胞增殖試劑盒、RIPA(強)組織細胞快速裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、山羊抗兔IgG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗抗體、LP ELISA試劑盒、NPY ELISA試劑盒、CCK-8 ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司)；熒光聚合酶鏈反應試劑盒(美國KAPABiosystems公司)；逆轉錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；LP、NPY一抗抗體(英國Abcam公司)；CCK-8一抗抗體(美國Invitrogen公司)。

1.4 主要實驗儀器 EPS300電泳儀、Tanon-5200全自動化學發光分析儀(上海天能)；Multiskan FC酶標儀(Thermo)；DMIL LED倒置相差顯微鏡(OLYMPS)；CFX-Connect 96熒光定量聚合酶鏈反應儀(Bio-Rad)；JY045-3C凝膠成像系統(北京君意)；DM3000顯微鏡(Leica)；ST16R型臺式高速冷凍離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 大鼠CSMCs簡化培養與細胞鑒定、保存 本實驗大鼠CSMCs原代培養參照劉啟艷簡化方法[11]進行CSMCs原代、傳代培養及鑒定、保存。

1.5.2 含藥血清制備 60只幼齡大鼠中取10只培養大鼠CSMCs，余50只大鼠參照文獻[12]實驗動物隨機分組法分為對照組，低、中、高劑量理脾復方制劑組，硫酸鋅組，每組10只。對照組灌胃給予等體積飲用水；硫酸鋅組灌胃給予20 mg/kg硫酸鋅口服溶液；低、中、高劑量理脾復方制劑組分別灌胃給予2.4、4.8、9.8 g/kg理脾復方制劑，各組每日灌胃1次，連續7 d，末次灌胃后1～2 h后予2%戊巴比妥鈉3 mL/kg，腹腔麻醉后股動脈采血，各組血液靜置2 h后，離心(2 000 r/min×10 min)后無菌分離血清，0.22 μm過濾器進行過濾，置于-20 ℃冰箱保存備用，使用時室溫恢復并采用高糖培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培養基稀釋成10%濃度。

1.5.3 CCK-8細胞增殖檢測 收集對數期第3代CSMCs，用DMEM培養基重懸細胞，調整細胞懸液濃度，接種于96孔板中(5×103個細胞/孔，每孔180 μL)，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液填充，同時設置調零孔(培養基)，對照孔(相應濃度、相應組別含藥血清)每組設3復孔，置37 ℃，5%CO2培養箱中培養過夜，細胞貼壁后按上述分組處理細胞，培養至各預設的時間點(0、2、4、6、8、12、24、36、48 h)，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養4 h后在酶聯免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值(OD值)，每組取3孔平均值，計算增殖率并繪制細胞增殖曲線，尋找含藥血清對大鼠CSMCs增殖影響最佳起始時間點。增殖率=(含藥血清組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。

1.5.4 酶聯免疫吸附法測CSMCs的LP、NPY、CCK-8蛋白濃度 提取10%含藥血清干預大鼠CSMCs至最佳增殖起始時間點，收集各組別細胞，提取總蛋白。嚴格按照LP、NPY、CCK-8酶聯免疫吸附法試劑盒操作進行。

1.5.5 蛋白質印跡法檢測CSMCs的LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量 將提取后各組CSMCs總蛋白，BCA法定量后，100 ℃水煮5 min蛋白變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳電分離蛋白移至聚偏二氟乙烯膜，經稀釋后的LP、NPY、CCK-8抗體孵育、電化學發光顯色后，置于凝膠成像儀中觀察各組LP、NPY、CCK-8蛋白表達的變化情況。

1.5.6 實時聚合酶鏈反應法檢測CSMCs的LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量 從NCBI基因庫中查尋目標基因序列，LP和GAPDH引物由武漢華聯科生物技術有限公司合成，CCK-8和NPY引物由武漢擎科創新生物技術有限公司合成。Trizol法提取各含藥血清組干預至最佳增殖起始點時CSMCs的RNA。引物序列如下：GAPDH，上游：5′-CAA GTT CAA CGG CAC AG-3′，下游5′-CCA GTA GAC TCC ACG ACA T-3′；CCK-8，上游：5′-AGC AGG TCC GCA AAG-3′，下游：5′-GGC CGA AAT CCA TCC-3′；LP，上游：5′-CCC ATT CTG AGT TTG TC-3′，下游：5′-GGT CTC GCA GGT TCT-3′；NPY，上游：5′-GAC CCT CGC TCT ATC C-3′，下游：5′-TTG ATG TAG TGT CGC AGA-3′；擴增片段長度分別為36，12，15，11 bp。選GAPDH作為內參基因。完成反轉錄反應體系和cDNA擴增反應體系，反應條件:95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，39個循環，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。以GAPDH為內參，用2-ΔΔCT法計算樣品中基因相對表達量。各組大鼠LP、NPY、CCK-8基因表達量(△Ct值)，△Ct=目的基因Ct-內參照基因Ct。

2 結果

2.1 10%理脾復方制劑和硫酸鋅含藥血清在24 h時開始穩定促進CSMCs增殖 見圖1。

圖1 10%含藥血清對正常大鼠CSMCs增殖的影響

圖1結果表明，在2 h時，高劑量理脾復方制劑組10%含藥血清抑制CSMCs增殖；在4 h時，除高劑量理脾復方制劑組外，其余各組10%含藥血清中的CSMCs增殖率呈持續、非勻速增高；在8 h及24 h時間點，各組CSMCs增殖率呈下降趨勢；24～36 h，各組CSMCs增殖率呈均速增高。此外，各組CSMCs在24 h以后，其增殖率均在20%以上，處于對數增長期，故此24 h為最佳起始時間點。

2.2 10%含藥血清干預大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白濃度 10%理脾復方制劑與硫酸鋅含藥血清上調大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白濃度，下調CCK-8蛋白濃度，見表1。

表1 10%含藥血清干預大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白濃度

表1結果表明，與對照組比較，10%理脾復方制劑含藥血清對大鼠CSMCs的LP、NPY蛋白濃度均為上調作用，差異有統計學意義(P<0.05)，上調作用呈高劑量理脾復方制劑組>中劑量理脾復方制劑組>低劑量理脾復方制劑組；對CCK-8均為下調作用，差異有統計學意義(P<0.05)，下調作用呈高劑量理脾復方制劑組>中劑量理脾復方制劑組>低劑量理脾復方制劑組。10%硫酸鋅含藥血清對LP、NPY蛋白濃度有上調作用，對CCK-8蛋白濃度有下調作用，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 10%含藥血清干預大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量 10%理脾復方制劑與硫酸鋅含藥血清上調大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白相對表達量，下調CCK-8蛋白相對表達量，見表2。

表2 10%含藥血清干預大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8蛋白相對表達量

表2結果表明，與對照組比較，10%理脾復方制劑含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白相對表達量均為上調作用，差異有統計學意義(P<0.05)，上調作用呈高劑量理脾復方制劑組>中劑量理脾復方制劑組>低劑量理脾復方制劑組，對CCK-8蛋白相對表達量各組蛋白均為下調作用，差異有統計學意義(P<0.05)，下調作用呈高劑量理脾復方制劑組>中劑量理脾復方制劑組>低劑量理脾復方制劑組。10%硫酸鋅含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY蛋白相對表達量有上調作用，對CCK-8蛋白相對表達量有下調作用。

2.4 10%含藥血清干預大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量 10%理脾復方制劑與硫酸鋅含藥血清上調大鼠CSMCs中LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量，見表3。

表3結果表明，與對照組比較，10%理脾復方制劑含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY mRNA相對表達量有上調作用，除低劑量理脾復方制劑組外，差異有統計學意義(P<0.05)，上調作用呈高劑量理脾復方制劑組>中劑量理脾復方制劑組>低劑量理脾復方制劑組，對CCK-8表達有上調作用，差異有統計學意義(P<0.05)，表達量上調趨勢呈低劑量理脾復方制劑組>中劑量理脾復方制劑組>高劑量理脾復方制劑組；10%硫酸鋅含藥血清對大鼠CSMCs中LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量有上調作用。

表3 10%含藥血清干預大鼠CSMCs后的LP、NPY、CCK-8 mRNA相對表達量

3 討論

結腸位于消化道末端，主要由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜四層組成，結腸肌層包括縱行肌和環形肌，這是結腸運動的基礎[13]，縱肌主要產生肌張力，環肌主要產生位相性收縮，共同將腸內容物推向直腸，以排出體外。攝食行為主要經過以下兩種方式影響結腸運動：進食與否：空腹時多見的袋狀往返運動，進食時見分節推進運動及多袋推進運動，這兩種運動均可推動食物殘渣向前運動，以促進結腸內容物排出體外[14]；胃-結腸反射：當機體攝入食物時，由于胃的拉伸而增加結腸的蠕動，而結腸蠕動可促進結腸排空，為食物增加消化空間，這種現象稱之為胃-結腸反射，其實質是食物攝入的結腸反應[15]，小兒進食時易引發胃-結腸反射[16]，兩種方式均與神經肽密切相關[15]。

LP、NPY、CCK-8既是胃腸道中的神經肽，亦是腦腸肽，三者均影響胃腸運動及食欲變化。LP是一種主要由脂肪細胞產生的相對分子質量16 000的多肽，骨骼肌、胃、腦下垂體等組織可能產生少量的LP。LP通過可溶性LP受體刺激阿黑皮素神經肽合成并產生α-促黑激素，發揮抑制食欲與減少體質量作用。NPY由36個氨基酸組成的活性單鏈多肽,由于結構中富含酪氨酸，故稱為神經肽酪氨酸，“Y”指的就是分子兩端的酪氨酸殘基，是最有效的食欲肽之一。CCK由115個CCK氨基酸前體衍生而來，包括硫酸化的CCK-8和CCK-7、非硫酸化的CCK-8和CCK-7、CCK-5等[17]，是第一個被證明具有厭食作用的腸道激素。既往研究發現CCK在腸道平滑肌的分布及興奮作用向直腸方向呈階梯遞減趨勢[18]，NPY的Y1和Y2受體mRNA在小鼠降結腸表達[19]，可溶性LP受體在胃腸道中大量存在[20]，傳入和傳出迷走神經末梢均含可溶性LP受體[21]。由此可推測，CSMCs分泌LP、NPY、CCK-8影響攝食行為，其藥物發揮治療厭食作用機制可能通過調節其CSMCs中的LP、NPY、CCK-8表達。故此，本實驗對治療小兒厭食的有效藥物，即理脾復方制劑和硫酸鋅口服液進行相關研究。

理脾復方制劑原名為運脾散(院內制劑名為運脾顆粒)，是貴州中醫藥大學治療厭食的經驗方，該方為“四君子湯”和“平胃散”化裁而來，由蒼術、白術、茯苓、山藥、薏苡仁、陳皮、枳殼、神曲、甘草共同組成。在該方藥物中，100%藥物含揮發油，揮發油多為芳香藥物所含，“香能通氣，能主散，能醒脾陰……能和合五臟”(《藥品化義》)。此外，芳香之藥有化濕、燥濕、理氣、溫中醒脾之效，如《醫方考》所言：“脾胃喜甘而惡苦，喜香而惡穢，喜燥而惡濕，喜利而惡滯……香能開胃竅。”另外，該方藥物中，100%藥物歸脾經，提示以健脾、運脾之效為主。最后，67%藥物甘味，44%藥物性味為辛、苦、溫，33%藥物性味為平，22%藥物性味為寒，提示組方藥物苦甘相得、辛苦相宜、溫寒并用，使該方充分發揮行濕、燥濕、化濕、下濕之效，“理順脾胃氣機轉樞，恢復胃納脾運”作用。但其發揮治療小兒厭食癥的作用具體機制則不詳。本研究結果發現，10%低、中、高劑量理脾復方制劑含藥血清促進CSMCs增殖，提示理脾復方制劑可影響結腸運動及CSMCs腦腸肽的表達。此外，本實驗研究發現，10%理脾復方制劑含藥血清有上調CSMCs中LP、NPY蛋白濃度、蛋白相對表達量、mRNA相對表達量，下調CCK-8蛋白濃度及蛋白相對表達量，且提示調節LP、NPY、NPY的作用隨理脾復方制劑的劑量增大而增強，證實理脾復方制劑有調控CSMCs中LP、NPY、CCK-8表達，這可能是理脾復方制劑發揮治療厭食作用的重要機制和靶點之一。

生長遲緩和攝食減少是鋅缺乏的早期癥狀[22]，研究顯示缺鋅飲食后的3～5 d內，食物攝取量被抑制[23]。由于鋅具有改善味覺及增進食欲的作用，許多早期厭食患兒家長及臨床兒科醫生給予補充鋅元素，鋅補充劑也被兒童普遍接受，且無論補充哪種鋅鹽(硫酸鋅、醋酸鋅或葡萄糖酸鋅)都是有效的[24]。但補充微量元素鋅是否影響CSMCs的增殖或其內腦腸肽的表達，未見相關報道。本實驗研究發現，10%硫酸鋅含藥血清促進CSMCs增殖，上調CSMCs中LP、NPY蛋白濃度、蛋白相對表達量、mRNA相對表達量，下調CSMCs中CCK-8蛋白濃度、蛋白相對表達量，證實硫酸鋅能調控CSMCs中LP、NPY、CCK-8表達，這可能是硫酸鋅發揮治療厭食作用的另一重要機制。

綜上，理脾復方制劑和硫酸鋅可促進CSMCs增殖，影響CSMC中LP、NPY、CCK-8的表達，可能是治療厭食的重要作用機制之一。但是，本研究結果發現，10%理脾復方制劑和硫酸鋅含藥血清對CCK-8 mRNA調控作用與蛋白濃度及蛋白相對表達量調控作用相反，這提示理脾復方制劑與硫酸鋅對CSMCs中CCK-8在轉錄和翻譯水平影響上可能不同，但其具體機制有待進一步研究。