基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討半夏-厚樸藥對治療癲癇的作用機(jī)制研究

楊燕， 任娟， 汪澤， 曹永軍， 王朝群， 何希瑞

癲癇是由大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致大腦短暫功能障礙的一種慢性疾病。全球約有6 000萬左右的癲癇患者，且以每年240萬病患人數(shù)遞增[1]。經(jīng)2～5年的規(guī)范治療，臨床上仍有約30%的患者對現(xiàn)有藥物產(chǎn)生了耐藥性[2-4]。癲癇患者由于長期大量使用抗癲癇藥物，產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的重大難題[5-6]。其中，兒童癲癇的發(fā)病機(jī)制與形式更為復(fù)雜、多樣[7]，其治療成為醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的重大難題。

中醫(yī)理論認(rèn)為癲癇證候繁多，病因復(fù)雜。歸納起來，可分為痰、火、風(fēng)、驚、血瘀、外傷等多種病因。其中，痰和火是癇病的主要病因[8]。半夏-厚樸作為相須相使藥對，出自《金匱要略》記載的半夏厚樸湯，具有行氣散結(jié)，降逆化痰之功效。藥對中半夏辛溫入肺胃，化痰散結(jié)，降逆和胃，主要用于痰飲眩悸，風(fēng)痰眩暈，痰厥頭痛等癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，350首中醫(yī)治療癲癇的方劑中，半夏位于單味藥物使用頻率的第四位[9]。厚樸苦辛性溫，下氣除滿，具有化濕導(dǎo)滯、化食消痰、驅(qū)風(fēng)鎮(zhèn)痛之效。方中厚樸助半夏散結(jié)降逆。研究發(fā)現(xiàn)，主要包含半夏和厚樸的組方能顯著降低癲癇大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體1 mRNA的表達(dá)，上調(diào)γ-氨基丁酸受體A基因及γ-氨基丁酸受體的表達(dá)[10]。鄧中甲教授運(yùn)用半夏厚樸湯治療失眠、驚悸、眩暈、脅痛等癥屬膽郁痰擾者，以及癲癇等癥見痰氣交阻者的臨床效果顯著，表明半夏及其配伍在治療癲癇疾病方面具有研究價(jià)值[11]。由于半夏和厚樸配伍后具有多成分、多靶標(biāo)、多途徑等特點(diǎn)，故其抗癲癇的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制較難闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是分析藥物與疾病和靶點(diǎn)之間“多成分、多靶標(biāo)、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的藥理學(xué)分支學(xué)科，其整體性、系統(tǒng)性等特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀及辨證論治原則一致，為研究中藥或復(fù)方有效成分、作用靶點(diǎn)、潛在機(jī)制等提供有效研究策略[12-14]。鑒于此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選半夏厚樸防治癲癇的主要有效成分、潛在作用靶標(biāo)，構(gòu)建“藥物-有效成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行潛在靶標(biāo)富集分析，探討其潛在作用機(jī)制，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)，Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)，小分子數(shù)據(jù)庫PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.rscb.org/)，網(wǎng)絡(luò)分析軟件Cytoscape(Version 3.6.0)，化學(xué)分子結(jié)構(gòu)軟件ChemBioDraw(Version 14.0)，分子對接軟件MOE(Version 2019)。

1.2 潛在有效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集半夏-厚樸藥對化學(xué)成分，并結(jié)合CNKI數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的半夏、厚樸相關(guān)文獻(xiàn)，構(gòu)建半夏-厚樸成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。按照口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18為條件進(jìn)行初步篩選[15-16]，得到半夏-厚樸藥對抗癲癇的潛在有效成分。

1.3 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 為了闡明半夏-厚樸的防治癲癇的分子機(jī)制及其與相關(guān)靶點(diǎn)之間的對應(yīng)關(guān)系，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其進(jìn)行分析，得到半夏-厚樸藥對主要有效成分及其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。將1.2中得到的半夏-厚樸潛在有效成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)做成對應(yīng)的關(guān)系表，即C-T.xlsx。然后將該表導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”(C-T)網(wǎng)絡(luò)模型，分別用不同顏色、形狀的節(jié)點(diǎn)表示半夏-厚樸藥對的潛在有效成分及作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集、生物過程富集分析 為了研究靶點(diǎn)蛋白在整體層面的相互作用，并更好地理解半夏-厚樸藥對的防治癲癇的作用機(jī)制，將1.3得到的半夏-厚樸藥對靶點(diǎn)信息匯總，保存為txt形式文件，并導(dǎo)入STRING在線分析平臺中，選取打分值>0.7(高置信度)作為過濾器，得到半夏-厚樸藥對的靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，并通過STRING 11.0的Analysis模塊進(jìn)行KEGG富集與生物過程分析。

1.5 分子對接 將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測得到的半夏、厚樸潛在有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為sdf格式，并對其進(jìn)行加氫及能量優(yōu)化，用于進(jìn)一步對接。從蛋白晶體數(shù)據(jù)庫(PDB)中下載過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)-α,PPAR-γ的三維晶體結(jié)構(gòu)。用MOE軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理，刪除多余水分子，然后進(jìn)行能量優(yōu)化。將半夏、厚樸潛在活性化學(xué)分子與PPAR-α,PPAR-γ進(jìn)行對接打分，利用Dock模塊進(jìn)行半柔性對接。對接允許配體分子中化學(xué)鍵旋轉(zhuǎn)，選擇打分函數(shù)為GBVI/WSA dG。打分函數(shù)表征了配體與受體的結(jié)合程度，打分值越小，表明配體-受體結(jié)合越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 半夏-厚樸藥對抗癲癇有效成分 本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺、CNKI數(shù)據(jù)庫共收集到半夏、厚樸的化學(xué)組分共259個(gè)。通過對這些化合物進(jìn)行口服生物利用度及類藥性的分析與篩選，得到潛在有效成分共15個(gè)(BX1～BX13，HP1，HP2)?；衔锏木幪?、名稱、分子量及參數(shù)見表1。

表1 篩選化學(xué)成分及口服生物利用度

2.2 半夏-厚樸藥對的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型及其分析 為了解釋半夏-厚樸藥對的抗癲癇作用機(jī)制，將上述15個(gè)潛在有效成分通過TCMSP計(jì)算平臺進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測與分析，得到半夏-厚樸藥對的靶點(diǎn)數(shù)55個(gè)，其中5個(gè)半夏成分(BX4,BX8,BX10,BX12,BX13)沒有得到預(yù)測靶點(diǎn)信息。通過Cytoscape軟件構(gòu)建半夏-厚樸中10個(gè)潛在有效成分與55個(gè)靶點(diǎn)之間的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)對應(yīng)關(guān)系圖，進(jìn)一步闡明半夏-厚樸抗癲癇作用的關(guān)鍵有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及其相互對應(yīng)關(guān)系(圖1)。

圖1中的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)共包含65個(gè)節(jié)點(diǎn)，分別由10個(gè)潛在有效成分和55個(gè)靶點(diǎn)組成。如圖1所示，“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中分別用不同形式的節(jié)點(diǎn)代表半夏-厚樸藥對的潛在有效成分及相應(yīng)的靶點(diǎn)。其中，藍(lán)色菱形節(jié)點(diǎn)表示半夏-厚樸藥對中經(jīng)口服生物利用度、類藥性篩選得到的潛在有效成分，黃色圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在有效成分群對應(yīng)的靶點(diǎn)。在圖1中，潛在成分對靶蛋白群的作用程度可以用節(jié)點(diǎn)的“度”來刻畫，度越高表示該成分能夠作用于更多的靶點(diǎn)，即該成分可以更多地參與到有機(jī)體的病理或生理過程。類似的分析也可以用于靶點(diǎn)，即靶點(diǎn)的度越高，它與藥物作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系更加密切。進(jìn)一步對半夏-厚樸藥對的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，黃芩素(BX3)、廿碳-11-烯酸(BX7)、β-谷甾醇(BX5)的中心度較高(黃芩素的中心度為22，廿碳-11-烯酸的中心度為10，β-谷甾醇的中心度為9)。

圖1 半夏-厚樸藥對的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 KEGG通路分析 通過富集分析可以獲得靶點(diǎn)基因的相關(guān)生物學(xué)功能。本研究利用STRING在線分析平臺，對半夏-厚樸抗癲癇的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)共有10條代謝通路(圖2)，分別是PPAR、類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、膽汁的分泌等代謝通路。半夏-厚樸藥對參與的生物過程如圖3所示，主要有脂肪代謝、類固醇激素代謝、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞應(yīng)答，激素應(yīng)答，小分子代謝及有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。這些生物過程參與癲癇的發(fā)生與發(fā)展，同時(shí)也受到癲癇疾病發(fā)作的影響。對脂肪代謝和類固醇激素代謝途徑的干預(yù)對難治性癲癇如Dravet綜合征和熱性驚厥的臨床治療具有重要意義和潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖2 KEGG通路富集分析半夏-厚樸藥對有效成分抗癲癇的核心靶標(biāo)

圖3 Biological Process富集分析半夏-厚樸藥對有效成分抗癲癇的相關(guān)生物過程

2.4 半夏-厚樸藥對靶蛋白群相互作用分析 為了研究半夏-厚樸藥對與靶蛋白之間的相互關(guān)系，我們對其治療癲癇相關(guān)的靶點(diǎn)群進(jìn)行了蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到圖4。如圖4所示，半夏-厚樸藥對治療癲癇的核心靶點(diǎn)之間存在明顯的協(xié)同相互作用關(guān)系。結(jié)合“成分-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)分析可以發(fā)現(xiàn)，半夏-厚樸藥對抗癲癇的潛在有效成分與核心靶點(diǎn)蛋白之間存在協(xié)同效應(yīng)，這種相互間協(xié)同作用改善了大腦的能量代謝和酮體代謝之間的聯(lián)系，產(chǎn)生協(xié)同增效的抗癲癇作用。

圖4 作用靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治龊湍K分析 為了明確半夏-厚樸藥對抗癲癇的關(guān)鍵有效成分及主要的作用靶點(diǎn)，本研究篩選到的潛在有效成分及其對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?。在得到的“成?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用Cytoscape軟件中的Network Analysis模塊對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯@取拓?fù)鋮?shù)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的中心度可以用節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間相互作用的路線數(shù)目來表征。例如，節(jié)點(diǎn)中心度等于1表示該節(jié)點(diǎn)只與網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用。節(jié)點(diǎn)的度越高，其代表的潛在有效成分或靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中相互作用的參與度越高。表2列出了半夏-厚樸藥對中潛在有效成分作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)列表。

表2 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?/p>

2.6 分子對接 本研究采用MOE對接模塊的半柔性對接模塊對PPAR靶點(diǎn)和半夏、厚樸的潛在有效成分逐一進(jìn)行分子對接，選取打分排名靠前的化合物表征，打分見表3。本研究選用GBSI/WSA dG函數(shù)作為打分函數(shù)，該打分函數(shù)準(zhǔn)確性高，可以更好的評估藥物分子與靶點(diǎn)間的結(jié)合能。打分函數(shù)描述了小分子與靶點(diǎn)間的結(jié)合能，其值越低說明配體與受體之間的相互作用越強(qiáng)。從表3可以看出，半夏中成分BX7，BX9，BX10與PPAR-α的對接打分分別為-9.378 3，-9.315 5，-9.076 9，與對照藥打分值(-9.654 9)相近，說明半夏中這些有效成分與PPAR-α有較強(qiáng)的相互作用，可能是半夏發(fā)揮藥理作用的靶點(diǎn)之一。同時(shí)，半夏中成分BX7，BX10與PPAR-γ的打分值為-8.923 7，-8.768 6，與對照藥打分(-9.099 1)接近，說明這些化合物可能半夏抑制PPAR活性的成分。圖5和圖6分別顯示了半夏有效成分BX8與PPAR-α和PPAR-γ間的相互作用。PPAR-α的Cys276、Met330、Met335與BX8形成3對氫鍵，穩(wěn)定了BX8與PPAR-α的相互結(jié)合。另外，PPAR-γ的Tyr473、His323、Arg288也可以與BX8形成3對氫鍵，從而穩(wěn)定它們之間的相互作用。

表3 半夏-厚樸藥對有效成分-核心靶點(diǎn)分子對接

圖5 半夏-厚樸藥對有效成分BX8-核心靶點(diǎn)分子PPAR-α(PDB:3VI8)對接模式圖

圖6 半夏-厚樸藥對有效成分BX8-核心靶點(diǎn)分子PPAR-γ(PDB:3VJH)對接模式圖

3 討論

癲癇影響全球1‰～2‰的兒童和0.5‰～1‰的人口。盡管診斷準(zhǔn)確且使用抗癲癇藥物進(jìn)行了規(guī)范治療，仍有大約30%的癲癇患者未得到有效治療或?qū)ΜF(xiàn)有藥物產(chǎn)生了耐藥性，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1-2,7-8]。研發(fā)安全高效的新型抗癲癇藥物是癲癇學(xué)界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題[3-4]。明代《醫(yī)學(xué)綱目·癲癇》將癲癇總結(jié)為“痰邪逆上也，孔竅不通，故耳不聞聲，目不識人，而昏眩倒仆也”，認(rèn)為癲癇病以痰為主，每由風(fēng)、火觸動。中醫(yī)藥治療癲癇具備多組分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)且不良反應(yīng)少的優(yōu)勢，可有效提高患者的生活質(zhì)量。半夏厚樸湯出自《金匱要略》，是治療情志不暢，痰氣互結(jié)所致梅核氣的常用方。方中君藥半夏苦辛溫燥，化痰散結(jié)，降逆和胃，臣藥厚樸苦辛而溫，行氣開郁，下氣除滿。兩藥為伍，行氣滯化痰結(jié)，共奏降逆化痰之功。近年來，實(shí)驗(yàn)研究或臨床觀察均證實(shí)半夏及半夏-厚樸藥對對癲癇具有一定的療效[10-11]，但對其抗癲癇的主要有效成分與作用機(jī)制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對半夏-厚樸藥對抗癲癇的有效成分和作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對抗癲癇的主要有效成分為黃芩素、黃芩苷、松柏苷、(E)-11-二十烯酸和桉葉油醇等。其中，化合物黃芩素和黃芩苷均被報(bào)道具有明顯的抗癲癇作用。特別是，黃芩苷可顯著抑制氯化鋰-匹羅卡品、戊四唑、紅藻氨酸致癲癇模型動物癲癇發(fā)作次數(shù)，提高海馬神經(jīng)元自噬活性、減少神經(jīng)元的凋亡與壞死，從而減輕癲癇所致大腦損傷[17-18]。臨床研究顯示，黃芩苷可顯著降低癲癇患者血清S100β和神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量，降低大腦神經(jīng)損傷，防止癲癇發(fā)作[19]。松柏苷的結(jié)構(gòu)與司替戊醇較類似，后者是臨床上用于治療2歲及以上服用氯巴占的患者與Dravet綜合征相關(guān)的癲癇發(fā)作[20-22]。半夏-厚樸藥對中其他幾個(gè)抗癲癇有效成分的抗癲癇活性研究尚處于空白階段。

通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對共有10條代謝通路，分別是PPAR、類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、膽汁的分泌、細(xì)胞間隙連接、葉酸合成、脂肪的消化與吸收等代謝通路。其中，半夏-厚樸藥對對PPAR信號通路的影響最為顯著。PPAR可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子/酪氨酸激酶受體B或能量代謝在癲癇發(fā)作中發(fā)揮保護(hù)作用，是治療癲癇最重要的藥物靶標(biāo)之一[23-24]。動物實(shí)驗(yàn)表明，PPAR-α或PPAR-γ選擇性激動劑可顯著提高癲癇發(fā)作閾值，提示PPAR可能參與了癲癇的控制[23]。類固醇激素作為治療癲癇的藥物之一，對其中一部分難治性癲癇具有良好療效[25-27]。特別是神經(jīng)類固醇激素如性激素和皮質(zhì)激素與突觸可塑性關(guān)系密切，參與癲癇的發(fā)病，也受癲癇發(fā)作的影響[27]?；ㄉ南┧岽x通路與炎癥發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而炎癥介質(zhì)可能既是癲癇的并發(fā)癥，也是某些癲癇發(fā)生的內(nèi)在誘因。如顳葉癲癇和皮質(zhì)發(fā)育不良導(dǎo)致的癲癇患者腦組織中存在白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-1受體1、白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子等大量的炎癥介質(zhì)[28-29]。脂肪的消化與吸收代謝通路與癲癇發(fā)生發(fā)展具有很高的關(guān)聯(lián)性。脂肪分解代謝產(chǎn)生的酮體在Dravet綜合征和熱性驚厥模型中顯示出顯著的抗癲癇作用，其可通過抑制谷氨酸能突出傳遞，激活A(yù)TP敏感鉀離子通道等途徑發(fā)揮抗癲癇活性[30]。本研究顯示，半夏-厚樸藥對通過影響這些與癲癇相關(guān)的代謝通路而發(fā)揮多靶標(biāo)、多通路的協(xié)同增效作用?！俺煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)顯示半夏-厚樸藥對有效成分治療癲癇的主要靶標(biāo)有PPAR，細(xì)胞色素P450 19A1、睪丸特異性雄激素結(jié)合蛋白等。考慮到PPAR是生酮飲食療法治療難治性癲癇的重要機(jī)制之一，實(shí)驗(yàn)選擇其作為核心靶標(biāo)，通過分子模擬對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對關(guān)鍵有效成分與PPAR-α存在較強(qiáng)的相互作用關(guān)系。因此，未來針對半夏-厚樸藥對抗癲癇相關(guān)活性及機(jī)制研究，可優(yōu)先從PPAR著手。

綜上，本研究結(jié)果初步驗(yàn)證和闡釋了半夏-厚樸藥對抗癲癇的有效成分和分子作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)半夏-厚樸藥對在治療癲癇方面顯示出較強(qiáng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。半夏-厚樸藥對治療癲癇呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特性，闡釋了中藥配伍相須相使、協(xié)調(diào)增效的科學(xué)內(nèi)涵，為半夏-厚樸藥對的臨床應(yīng)用提供理論參考，為后續(xù)深入研究半夏-厚樸藥治療癲癇的物質(zhì)基礎(chǔ)、有效成分的二次開發(fā)及藥理作用機(jī)制提供了思路和借鑒。