復方腸泰抑制小鼠結腸癌血管生成及其機制的實驗研究

劉靜冰，李靈常，余佳霖，魏國利，姜子瑜，霍介格

（南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院腫瘤科，南京 210028）

結直腸癌是我國發病率和病死率位居第一的消化系統惡性腫瘤，嚴重威脅居民生命安全。手術、放療、化療和靶向治療是結直腸癌的重要治療手段，中醫藥在其綜合治療中發揮著日益重要的作用。復方腸泰系南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院腫瘤科治療結腸癌的經驗方，已制成院內制劑應用于臨床。臨床研究表明[1]：復方腸泰聯合化療顯著改善腸癌患者臨床癥狀，提高生活質量，降低癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）水平，提高T 淋巴細胞分型為代表的多項免疫指標，降低白細胞減少發生率，起到減毒增效作用。課題組前期研究發現，在人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）模型中，復方腸泰具有顯著抗新生血管生成作用[2]，故本研究以CT26.WT 結腸癌細胞小鼠移植瘤為研究對象，觀察其對結腸癌新生血管生成的影響，并初步探討其作用機制。

1 實驗材料

小鼠結腸癌細胞（CT.26WT）：貨號C3005，上海冠導生物有限公司。雌性ICR 小鼠：代碼201，18 ～20 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司。無血清培養基（SFM）：貨號17705-021，品牌Gibco，規格500 mL，南京信帆生物。BCA 蛋白定量試劑盒：產品貨號KTD3001，品牌Abbkine，武漢艾美捷科技有限公司。Promega M-MLV 逆轉錄酶：貨號M1701，品 牌 普 洛 麥 格。SYBR? Premix Ex TaqTM ：貨 號DRR081A，品牌TaKaRa。VEGFR2、AKT、p-AKT、HIF-1α 和GAPDH 一抗：貨號分別為#9698、#4691、#4060、#36169 和#5174，品牌Cell signaling。Antirabbit IgG，HRP-linked Antibod 二抗：貨號#7074，品牌Cell signaling。復方腸泰處方：人參10 g，黃芪15 g，藤梨根15 g，薏苡仁20 g，苦參6 g，八月札10 g。加10 倍體積水浸泡30 min 后煮2 h，藥渣加8 倍水再煮2 h，煎煮液100 目篩網過濾，冷卻后2 次濾液經蒸發儀濃縮至220 mL，作為飲片水煎液，生藥濃度2.50 g/mL。加入PBS 于離心機10 000 r/min 離心10 min后取上清液，根據不同濃度需要加入一定量的PBS 稀釋，使用濾器過濾除菌，于4 ℃冰箱保存備用。

2 實驗方法

2.1 建立小鼠結腸癌模型及分組 將小鼠結腸癌細胞CT26.WT 從液氮儲存罐中復蘇后，37 ℃下溶解，于RPMI 1640 培養基（含10 %的胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和100 U/mL 的鏈霉素）中穩定生長。按2 ×107/mL 的濃度在20 只ICR 小鼠皮下注射0.2 mL 細胞懸液，構建小鼠結腸癌模型。待瘤體生長至100 mm3～150 mm3隨機分組，共分4 組，每組5 只。參考課題組既往實驗數據[3]，對照組用生理鹽水灌胃，低劑量組復方腸泰13.90 g/kg 灌胃，中劑量組復方腸泰27.80 g/kg 灌胃，高劑量組復方腸泰55.60 g/kg 灌胃。

2.2 測量轉移瘤體積變化 生理鹽水將復方腸泰稀釋成不同濃度，小鼠每天灌胃1 次，每次0.2 mL，持續給藥13 d。給藥開始計為d 1，隔日記錄各組小鼠移植瘤體積，先測量腫瘤體積再給藥。腫瘤體積計算公式：V = 長徑 × 短徑2 /2。小鼠連續灌胃13 d 后處死，完整剝離腫瘤組織。

2.3 免疫組化檢測轉移瘤微血管密度（microvessel density, MVD） 小鼠腫瘤組織制片后使用CD34 抗體標記血管內皮，反映MVD。MVD 測定參照Weidner的微血管計數方法：首先于低倍鏡（× 40）下觀察全部視野，選擇3 個高密度的血管組織的“熱點”區，即棕黃染色密度最高的區域；然后在高倍鏡（× 400）下雙盲法計數微血管。呈現單個或聚集在一起的數個被染為棕黃色或棕褐色的內皮細胞，獨立于鄰近的微血管、腫瘤細胞或其他結締組織，作為1個微血管計數，計數3 個視野，取其均值作為MVD。管腔大于8 個紅細胞直徑或管壁帶有肌層的大血管不作為新生血管計數。

2.4 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 的濃度 小鼠尾靜脈取血，使用ELISA 檢測試劑盒檢測小鼠血清內皮生長因子（VEGF）、細胞表面分化抗原44v6（CD44v6）和金屬基質蛋白酶-2（MMP-2）濃度。

2.5 聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測腫瘤組織VEGFR2和HIF-1α mRNA 的轉錄水平 使用TRIzol 試劑提取小鼠瘤組織中的總RNA，設計上下游引物擴增（引物序列見表1），取2 μg RNA 運用Promega MMLV 逆轉錄酶及相關試劑進行逆轉錄反應，反應體系為20 μL。取0.5 μL RT產物運用SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa）進行RT-PCR 反應。反應條件如下：PCR 程序設置為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 40 s 共40 個循環。GADPH 作為內參，用2-△△Ct法測定RNA 含量。

表1 目標基因的引物序列

2.6 蛋 白 印 跡（Western Blot） 檢 測 腫 瘤 組 織VEGFR2、HIF-1α、AKT 和p-AKT 的表達 皮下移植瘤標本用PBS 洗滌后，使用超聲粉碎機粉碎，于6 000 r/min 離心5 min 后提取蛋白，BCA 蛋白分析試劑盒測定蛋白含量。SDS-PAGE 凝膠電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶中封閉50 min。加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次后，室溫加入二抗孵育50 min。使用ECL 發光劑與膜反應曝光，掃描捕捉蛋白條帶。

2.7 統計學方法 使用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。所有數據均以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用ANOVA 分析。

3 結果

3.1 復方腸泰抑制小鼠移植瘤生長 小鼠予不同劑量復方腸泰灌胃。對照組小鼠瘤體增長迅速，復方腸泰組瘤體增長緩慢，且劑量越高增長越緩慢，呈劑量依賴性（圖1）。小鼠給藥結束后處死，剝離腫瘤，復方腸泰劑量越高，小鼠腫瘤體積越小（圖2）。

圖2 各組小鼠移植瘤剝離后體積

3.2 復方腸泰降低結腸癌組織MVD MVD 是評價腫瘤血管生成的公認指標，通過免疫組化CD34 染色，可以看到對照組染色最深，復方腸泰組不同程度染色減少，且劑量越高CD34 染色越少（圖3）。說明復方腸泰具有抑制小鼠結腸癌血管生成的作用，且該抑制作用具有劑量依賴性。

圖 1 小鼠移植瘤體積變化曲線

圖3 小鼠移植瘤CD34 免疫組化染色強度

3.3 復方腸泰降低小鼠血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 表達 與對照組相比，隨著復方腸泰劑量增加，小鼠血清VEGF、CD44v6 和MMP-2 水平逐漸降低（見表2）。復方腸泰可抑制小鼠血清中VEGF、CD44v6和MMP-2 的表達，抑制作用與劑量有關。

表2 小鼠移植瘤VEGF、CD44v6 和MMP-2 表達 μg/L

3.4 復方腸泰抑制小鼠移植瘤VEGFR2 和HIF-1α mRNA 的轉錄 經復方腸泰處理后，小鼠移植瘤中血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）和缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的mRNA 轉錄水平較對照組均不同程度降低，并呈劑量依賴性關系（見圖4）。

圖4 小鼠移植瘤VEGFR2 和HIF-1α mRNA 水平

3.5 復方腸泰抑制小鼠移植瘤VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白表達 復方腸泰抑制小鼠移植瘤中VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白的表達，p-AKT/AKT比值顯著下降，且呈現劑量依賴性（見圖5）。

圖5 小鼠移植瘤VEGFR2、HIF-1α、AKT 和p-AKT 蛋白的表達

4 討論

早在1971 年，哈佛大學醫學院Folkman 教授首次提出了腫瘤生長依賴于血管生成的觀點[4]，認為腫瘤細胞通過分泌促血管因子，刺激腫瘤產生新生血管，為腫瘤生長供應血液和營養，隨后腫瘤血管新生被認為是腫瘤十大惡性生物學行為之一[5]。“抗腫瘤血管生成”已成為晚期惡性腫瘤的重要治療策略，在晚期結直腸癌中尤為重要。一項在晚期結直腸癌患者中比較IFL 化療方案聯合貝伐珠單抗和單用化療的臨床研究發現[6]，聯合組較對照組取得了4.7 個月的生存獲益（20.3 m vs. 15.6 m），抗血管生成藥物也已寫入中國、美國、歐洲等眾多國家和地區的結直腸癌診療指南中。

現代藥理學研究發現，很多中藥復方、中藥單體以及中藥注射劑也具有抗腫瘤新生血管生成的作用。活血化瘀類的桃紅四物湯、血府逐瘀湯，軟堅散結類的鱉甲煎丸等，均通過抑制血管內皮生長因子（VEGF）發揮抗腫瘤血管生成的作用[7]。中藥單體的研究則更為廣泛而深入。黃芩提取物燈盞花乙素可下調VEGF，從而抑制腫瘤血管生成，其機制可能與抑制AKT 磷酸化有關[8]。人參皂苷Rg3 在體外和體內均有顯著抗血管生成作用，可以抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的遷移、黏附和小管的形成[9]；Rg3 聯合索拉非尼可抑制小鼠肝移植瘤生長，其機制可能與調控血管生成相關因子HIF-1α、VEGF 和VEGFR2 相關[10]。復方腸泰組方包括人參、薏苡仁、白花蛇舌草、莪術、八月札和藤梨根六味中藥，課題組前期研究發現，復方腸泰對HUVEC 的遷移、增殖和小管形成具有抑制作用，體內抑制小鼠matrigel 栓形成，因此推測其對腫瘤組織應該也有抗血管生成作用[2]。

本研究中復方腸泰顯著抑制小鼠皮下移植瘤的生長，降低了腫瘤組織的微血管密度。進一步檢測相關細胞因子和蛋白表達，復方腸泰抑制結腸癌移植瘤小鼠血清中VEGF、CD44v6 和MMP-2 水平，下調移植瘤中VEGFR2 和HIF-1α 的mRNA 轉錄，抑制移植瘤中VEGFR2、HIF-1α 和p-AKT 蛋白的表達。VEGF 在血管的新生和發展中發揮重要的調控作用，是關鍵的促血管生成因子，參與了腫瘤的發展、侵襲和轉移，是結腸癌的重要不良預后因子[11]。MMP-2 和CD44v6與腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲密切相關，MMP-2 水平的升高促進了結腸癌細胞的轉移[12]，CD44v6 在結腸癌組織中高表達且與不良預后相關[13]。HIF-1α 是缺氧環境下細胞活動的重要調控因子，缺氧時HIF-1α 被激活，它不僅使VEGF mRNA 穩定性增加，而且增加VEGF 的轉錄活性，刺激新生血管生成[14]。AKT 信號通路與結腸癌新生血管生成密切有關，AKT 失活可以抑制結腸癌新生血管的生成，磷酸化的AKT 蛋白p-AKT 是其主要活性形式[15]。

綜上所述，本研究結果表明，復方腸泰可以抑制小鼠結腸癌移植瘤的血管生成，下調VEGF、CD44v6和MMP-2 等與血管生成相關細胞因子的表達，其作用機制可能與抑制HIF-1α 的表達和AKT 蛋白的磷酸化有關。