水貂犬瘟熱病毒RT-PCR的診斷

曹志偉

（萊西市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 266600）

犬瘟熱(canine distemper,CD)是一種傳染性極強(qiáng)的烈性傳染病,由犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)感染引起，能使多種動(dòng)物自然感染和發(fā)病，包括食肉目犬科、貂科和浣熊科，但不傳染人類和貓。感染犬瘟熱后，病畜以呈現(xiàn)雙相熱型、皮屑、嚴(yán)重的消化道障礙和呼吸道炎癥等為特征，有特殊的腥臭味，偶有神經(jīng)癥狀，發(fā)病死亡率較高[1]。

早在18世紀(jì)的后葉歐洲即有犬瘟熱病毒病的存在，Carre氏于1905年發(fā)現(xiàn)病原為病毒。我國水貂犬瘟熱首發(fā)于1968年，近年來，犬瘟熱病毒不斷侵染各種動(dòng)物，特別是給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失，故稱此病為毛皮動(dòng)物三大疫病之一。

1 材料與方法

1.1 材料

山東省某水貂場送檢的疑似犬瘟熱的病死水貂2只（未接種犬瘟熱疫苗），無菌采集病貂肝臟和肺臟作為病毒分離材料，分別放入已標(biāo)好序號(hào)的無菌病料采集袋中，置-20℃保存。

1.2 方法

本試驗(yàn)采用RT-PCR擴(kuò)增方法診斷犬瘟熱病毒，即反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction)。

1.2.1 試驗(yàn)處理

在GenBank中，根據(jù)已報(bào)道的CDV毒株核蛋白基因(N)序列，選擇基因保守序列作為PCR擴(kuò)增的靶序列，用Prinler 5.0軟件分別設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增287bp的N基因引物，42℃水浴60min，反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。

1.2.2 PCR反應(yīng)

將cDNA置于PCR反應(yīng)體系中，用振蕩器振蕩混勻，將28μL體系分裝入200μL的離心管，加反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（模板）2.0μL，吹打，搖晃至無氣泡進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)過94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸90s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min等程序，靶序列被放大上萬倍甚至上百萬倍從而被檢測出來[2]。

2 結(jié)果與分析

本試驗(yàn)通過凝膠電泳技術(shù)對(duì)是否有核酸片段擴(kuò)增進(jìn)行判斷，用擴(kuò)增產(chǎn)物的基因片段大小與目的基因片段大小進(jìn)行比對(duì)，若一致，即可判定病料中含有犬瘟熱病毒。

2.1 RT-PCR產(chǎn)物的檢測（瓊脂糖凝膠電泳）

2.1.1 配制瓊脂糖凝膠溶液，使凝膠厚度在3～5mm之間。

2.1.2 取6μL樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL 6×loading Buffer混合均勻，分別加入對(duì)應(yīng)的加樣孔中，隨后，把DNA Maker加入第3孔中，作為分子量對(duì)照，1和5兩孔分別加入陰性和陽性對(duì)照。

2.1.3 將凝膠放入電泳緩沖液中，采用電壓120V，電流60mA，恒壓電泳20min，然后放入紫外凝膠成像系統(tǒng)鑒定，拍照。

2.2 檢測結(jié)果

凝膠電泳結(jié)果

由于犬瘟熱病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳片段為287bp。由此判斷該貂場送檢的2只水貂中有一只感染犬瘟熱病毒。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本文選擇保守性較強(qiáng)的N基因的5’端非編碼區(qū)，設(shè)計(jì)合成引物，用RT-PCR方法對(duì)犬瘟熱病毒擴(kuò)增出了特異性的片段大小為287bP的產(chǎn)物，而本試驗(yàn)擴(kuò)增病料中片段與287bP相符，因此說明RT-PCR方法是特異的，同時(shí)該病料即被確診為含有犬瘟熱病毒。在低溫條件下保存的犬瘟熱病料仍能被RT-PCR方法檢測出來[3]，表明了RT-PCR診斷方法具有較高敏感性，可以用于犬瘟熱的臨床診斷。

除具有較高敏感性外，RT-PCR診斷方法所使用的試劑容易購買，對(duì)不同疾病進(jìn)行檢測時(shí)，唯一的不同點(diǎn)在于引物設(shè)計(jì)，而所使用的試劑則幾乎相同[4]。在眾多的診斷方法當(dāng)中，RTPCR具有非常明顯的優(yōu)越性，以ELISA方法為例，該方法所用到的單克隆抗體、抗血清很難購買到，也存在假陰性的問題，敏感性不佳[5]。而對(duì)于RT-PCR診斷方法而言，試驗(yàn)前，可以利用糞便等多種病料處理后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，有利于對(duì)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及大型野生動(dòng)物診斷，從而解決臨床病例的確診問題。

3.2 結(jié)論

通過對(duì)兩只疑似犬瘟熱的水貂進(jìn)行犬瘟熱病毒RT-PCR的診斷，一只被確診為陽性，表明RT-PCR診斷犬瘟熱具有強(qiáng)特異性、高敏感性，同時(shí)，取材方便、檢測快速、對(duì)檢測樣品要求低也是RT-PCR診斷方法的一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)中RTPCR擴(kuò)增以犬瘟熱病毒的特定堿基序列為測目標(biāo)，針對(duì)性極強(qiáng)，因RT-PCR方法檢測的是病毒的核酸，與生物化學(xué)和免疫學(xué)相比，其檢測結(jié)果與病毒分離培養(yǎng)結(jié)果更為一致。